Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

HPLC aplikace 1 Využití HPLC v analýze potravin. HPLC aplikace 2.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "HPLC aplikace 1 Využití HPLC v analýze potravin. HPLC aplikace 2."— Transkript prezentace:

1 HPLC aplikace 1 Využití HPLC v analýze potravin

2 HPLC aplikace 2

3 3

4 4 Stanovení přirozených složek potravin

5 HPLC aplikace 5 Lipidy Nasycené a nenasycené triacylglyceroly – zpracování potravin Nízká stabilita triacylglycerolů obsahujících nenasycené mastné kyseliny Reakce se světlem a kyslíkem – vznik hydroperoxidů – ovlivnění chuti a kvality tuků Falšování přídavkem jiných tuků, použití ztužených tuků – stanovení obsahu triacylglycerolů (př. falšování olivového oleje) Stanovení triacylglycerolů, hydroperoxidů, sterolů a vitaminů UV-DAD spektra – stopy hydroperoxidů nasycené x nenasycené triacylglyceroly Př. nenasycené triacylglyceroly v olivovém oleji – charakteristické spektrum Příprava vzorku – extrakce petroletherem, rozpuštění v THF

6 HPLC aplikace 6 Profil triacylglycerolů Starý slunečnicový olej Odezva při 240 nm – hyroperoxidy

7 HPLC aplikace 7 Analýza olivového oleje 280 nm – konjugované dvojné vazby – špatná kvalita oleje

8 HPLC aplikace 8 Profil triacylglycerolů v olivovém oleji

9 HPLC aplikace 9 Mastné kyseliny Stanovení nenasycených mastných kyselin C 4 -C 22 Př. máslo a margariny se liší v zastoupení kyseliny máselné v triacylglycerolech Stanovení jednotlivých mastných kyselin Hydrolýza (horký metanol a KOH), online derivatizace (bromid fenacylbromidu - zavedení chromoforu) - HPLC/UV

10 HPLC aplikace 10 Složení tuku

11 HPLC aplikace 11 Sacharidy Glukosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, mannitol, sorbitol, laktosa, maltosa, cellobiosa, sacharosa Nepřítomnost chromoforu nebo fluoroforu: nelze UV-VID nebo FLD RID – hladiny mg/kg Elektrochemická detekce - hladiny µg/kg Příprava vzorku (dle matrice): odplynění, filtrace, extrakce, SPE přečištění

12 HPLC aplikace 12 Stanovení sacharidů

13 HPLC aplikace 13 Vitaminy Přírodní i syntetické Zlepšení nutriční hodnoty potravin Ve vodě rozpustné vitaminy: C, B 6, B 2, B 1, B 12 V tuku rozpustné vitaminy: E, D, A Hladiny µg/kg Labilní (světlo, teplo) UV, DAD – kvalitativní i kvantitativní stanovení Elektrochemická detekce

14 HPLC aplikace 14 UV detekce

15 HPLC aplikace 15 Elektrochemická detekce Vitaminový přípravek

16 HPLC aplikace 16 V tuku rozpustné vitaminy UV detekce

17 HPLC aplikace 17 V tuku rozpustné vitaminy Elektrochemická detekce

18 HPLC aplikace 18 Tokoferoly – normální fáze

19 HPLC aplikace 19 Stanovení tokoferolů v extraktu margarinu FLD detekce

20 HPLC aplikace 20 Biogenní aminy Stanovení biogenních aminů Volné aminy přítomny v potravinách a nápojích (ryby, sýry,víno, pivo) Maximální přípustné hladiny MRL derivatizace

21 HPLC aplikace 21 UV detekce Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid)

22 HPLC aplikace 22 Aminokyseliny Primární a sekundární aminokyseliny v jednom stanovení Stanovení původu masných výrobků – falšování potravin Chirální stacionární fáze stanovení D a L formy Automatická online derivatizace - předkolonová, FLD detekce Příprava vzorku: hydrolýza (HCL, enzym)

23 HPLC aplikace 23 STANOVENÍ AMINOKYSELIN Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselinPříprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin - převedení aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy volných aminokyselin Analytická koncovkaAnalytická koncovka – přesnost, správnost, rychlost HPLC Separace - ionexy (automatické analyzátory aminokyselin) reverzní fázi - oktadecyl (C18), gradientová eluce Detekce a kvantifikace – po předchozí derivatizaci Derivatizace před i za kolonou, UV i fluorescenční detekce interní standard kompenzuje: nižší výtěžky derivatizační reakce ztráty při přípravě vzorku variabilní objem při nástřiku vzorku Jako vnitřní standardy se používají: norleucin, norvalin, - aminomáselná kyselina, -aminomáselná kyselina, -aminomáselná kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj.

24 HPLC aplikace 24 Derivatizační činidla Derivatizační činidla o-Phthaldialdehyd (OPA) 9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl) Ninhydrin Dansylchlorid AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamát) Phenylisothiokyanát (PITC)

25 HPLC aplikace 25 o-Phthaldialdehyd (OPA) o-Phthaldialdehyd (OPA) Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s primárními aminokyselinami - rychlá, za laboratorní teploty Výhoda - sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají vynikající fluorescenci excitační maxima 340 nm, emisní maxima 450 nm Nevýhoda - reaguje pouze s primárními aminokyselinami

26 HPLC aplikace 26 Separace OPA derivátů aminokyselin Chromatografické podmínky Gradient: solvent A: 15 mM Na2HPO4 pH 7,2/tetrahydrofuran (96+4); solvent B: 15 mM Na2HPO4/CH3OH/CH3CN ( ). Průtok: 3,5 ml/min; program: % B/A, 27 min. Kolona: Radial Pak 5  m C18 cardtridge.

27 HPLC aplikace 27 Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel používaných k derivatizaci aminokyselin CharakteristikaOPAFMOC-ClNinhydrinDns-ClAQCPITC DetekceFLD UVUV (FLD)FLDUV Citlivostfmol  mol pmol (nmol)fmolpmol Stabilita derivátušpatnádobrá--dobrá střední Rychlost derivatizace rychlá malá rychlástřední Sekundární aminokyseliny neano Interference reagentu neanoneano Interference matrice malýstřednínemalýnevysoký

28 HPLC aplikace 28 Stanovení aminokyselin v pivu po derivatizaci (OPA)

29 HPLC aplikace 29 Stanovení aminokyselin v bramborách (HPLC/FLD v reverzní fází, derivatizace OPA) Podmínky stanovení: analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5m) analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 m) teplota kolony: 30 °C mobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mM Na2EDTA; methanol (Merck); pH 6,4 gradientová eluce: 0 – 15 min % methanolu min. 50 % methanolu průtok: 0,7 ml/min nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo v nástřikové smyčce desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu FLD detektor: ex = 340 nm; em = 455 nm

30 HPLC aplikace 30 Chirální separace optických izomerů kolona : 25 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil Chiral-1 eluent : 1 mM vodný roztok (CH3COO)2Cu (pH = 5,6) průtok eluentu : 1,2 ml/min teplota : 60 ˚C detekce : UV 240 nm 1. D-alanin 2. L-alanin D,L-alanin

31 HPLC aplikace 31 Bílkoviny kolona : 25 cm x 9,4 mm stac. fáze : Zorbax GF-250 eluent : 130 mM NaCl + 20 mM KCl + 50 mM Na2HPO4 (pH = 7,0) průtok: 1 ml/min detekce : UV 210 nm 1. myší IgM, Mh = hovězí thyroglobulin, Mh = β-amylasa z brambor, Mh = hovězí serum albumin, Mh = kuřecí albumin, Mh = hovězí RNAasa, Mh = azid (tmax), Mh = 65

32 HPLC aplikace 32 Stanovení peptidů fytochromu V semenech ovsa rostoucích ve tmě HPLC/UV a MS detekce UV mapování

33 HPLC aplikace 33 Stanovení peptidů fytochromu semena ovsa rostoucí ve tmě LC-MS TIC MS spektrum T12 a T58

34 HPLC aplikace 34 Deriváty purinu kolona : 30 cm x 4 mm stac. fáze : Nucleosil 50-5 eluent : methanol-voda-dichlormethan 47:17:936 (v/v/v) průtok: 0,8 ml/min detekce: UV 280 nm 1. kofein 2. theofyllin 3. theobromin

35 HPLC aplikace 35 HPLC/UV analýza fytoestrogenů (po SPE přečištění) přečištění SPE bez přečištění

36 HPLC aplikace 36 Stanovení glykoalkaloidů v rajčatech LC-MS/MS Porovnání HPLC-UV a LC-MS/MS metody Parametry metodyHPLC-UVLC-MS/MS AnalytyTomatinDehydrotomatinTomatinDehydrotomatin Opakovatelnost4% Nelze stanovit 2,6%3,1% Výtěžnost 85,0% (100 mg/kg) 94,4% (9 mg/kg) 82,9% (0,9mg/kg) Detekční limit (LOD)2 mg/kg0,1 mg/kg0,05 mg/kg Mez kvantifikace (LOQ)6 mg/kg0,3 mg/kg0,15 mg/kg HPLC-UV a LC-MS/MS chromatogram vzorku R40 (zelené rajče) LC-MS/MS 20x nižšího LOD, lepší opakovatelnost a výtěžnost ve srovnání s HPLC-UV (vhodná pro zralá rajčata)

37 HPLC aplikace 37 Potravinářská aditiva

38 HPLC aplikace 38 Acidulanty a regulátory kyselosti Kyselina sorbová a citrónová Octová, propionová, jantarová, adipová, mléčná, fumarová, jablečná, vinná kyselina Ochucovadla - zintenzivnění chuti, maskování nežádoucích pachutí Pufrování – kontrola pH (zpracování potravin, finální výrobky) Konzervační prostředky, zamezení růstu mikroorganismů Prevence žluknutí a hnědnutí – antioxidační účinky Úprava viskozity pečených výrobků Přídavky při tavení - tavené sýry, cukrovinky Zlepšení barvy a chuti při konzervování masa Destilace s vodní parou, SPE HPLC UV/DAD

39 HPLC aplikace 39 Bílé víno

40 HPLC aplikace 40 Citrónová kyselina ve vodce

41 HPLC aplikace 41 Antioxidanty

42 HPLC aplikace 42 HPLC/UV-VIS (DAD) antioxidantů Žvýkačka

43 HPLC aplikace 43 Konzervační prostředky Benzoová kyselina Sorbová kyselina Propionová kyselina Methyl-, ethyl-, propyl- estery p-hydroxy benzoové kyseliny (PHB.methyl, PHB-ethyl, PHB-propyl Inhibice růstu mikroorganismů Prodloužení životnosti potravin

44 HPLC aplikace 44 HPLC/UV-VIS (DAD)

45 HPLC aplikace 45 Umělá sladidla Acesulfam Aspartam Sacharin Nízkokalorická sladidla: nápoje Regulace hladin – legislativa Možný toxický účinek

46 HPLC aplikace 46 Aspartam On-column derivatizace, PR chromatografie Srovnání spektra derivatizovaného (OPA) a nederivatizovaného aspartamu

47 HPLC aplikace 47 Syntetická barviva Použití: při zpracování potravin ve farmaceutickém průmyslu v chemickém průmyslu Zakrytí kazů, zvýraznění barvy potravin, zamaskování vlivů zrání a stárnutí Zlepšení přitažlivosti potravin Kontrola kvality, stanovení stopových koncentrací původních látek a degradačních produktů – vývoj citlivých a selektivních analytických metod HPLC/UV-VIS - charakteristická maxima 400 nm (žlutá) – 500 nm (červená) – 600 – 700 nm (zelená, modrá, „černá“)

48 HPLC aplikace 48 Syntetická barviva v limonádě Spektra žlutého, červeného, modrého a „černého“ barviva

49 HPLC aplikace 49 Ochucovadla Zlepšení chuti potravin Nejčastěji použité látky: Esenciální oleje (silice), hořké látky, ostré pálivé látky Příklady: Lupulon a humuklon (hořké látky chmele) Vanilin Naringenin a hesperidin (hořké látky) Nejčastěji používaná metoda: GC (head-space, SPME) HPLC – málo těkavé látky, tepelně nestabilní látky

50 HPLC aplikace 50 Vanilin HPLC/UV, RP Kvalita extraktu vanilinu

51 HPLC aplikace 51 Stanovení vanilinu v koňaku Identifikace srovnáním spekter

52 HPLC aplikace 52 Hořké látky: hesperidin a naringenin Pomerančový džus HPLC/UV, RP

53 HPLC aplikace 53 Rezidua a kontaminanty

54 HPLC aplikace 54 Aplikace v reziduální analýze Analýza stopových množství sledovaných látek: - vysoká citlivost analytické metody - nízké meze stanovitelnosti (závisejí na citlivosti a šumu použitého detektoru, na zředění látky při průchodu kolonou a na rušivých vlivech daných složkami mobilní fáze či kontaminanty v mobilních fázích nebo v analyzovaném vzorku. Pro ideální (gaussovský) profil píku lze odvodit vztah mezi výškou píku, zaznamenaného detektorem, a koncentrací látky ve vzorku, dávkovaném do chromatografu, Zlepšení citlivosti - ovlivnění faktorů na pravé straně rovnice, tak aby byla výška píku maximální. Snížení mezí detekce - zvýšení odstupu signálu od šumu Snížení šumu - termostatovaná kolona a cela detektoru, použití čerpadel se stabilním hladkým průtokem, mobilních fází připravených z velmi čistých složek (zejména při gradientové eluci), důkladně odplyněných a přečištěním vzorku

55 HPLC aplikace 55 Nejčastější aplikace Stanovení reziduí léčiv (stanoveny MRL) (dobytek drůbež, maso, mléko, vejce …; působení rezistence) Chemoterapeutika (sulfonamidy, antibiotika …) Antiparazitika hormony Mykotoxiny Polyaromatické uhlovodíky Pesticidy Příklady:

56 HPLC aplikace 56 Rezidua léčiv ve vzorcích vajec HPLC/UV-VIS (DAD); RP

57 HPLC aplikace 57 Stanovení reziduí tetracyklinů v mase HPLC/UV-VIS (DAD); RP LOD 0,1 mg/kg

58 HPLC aplikace 58 Mykotoxiny: Fumonisiny - Fusarium monoliformae LC/MS MS spektra fumonisinu B1, 2, 3

59 HPLC aplikace 59 Identifikace fumonisinů ve vzorcích kukuřice, Následná konfirmace dle fragmentových iontů

60 HPLC aplikace 60 Mykotoxiny

61 HPLC aplikace 61 Mykotoxiny

62 HPLC aplikace 62 Mykotoxiny Aflatoxiny HPLC UV/FLD

63 HPLC aplikace 63 HPLC/FLD stanovení zearalenonu Porovnání přečištění pomocí SPE a GPC Zearalenon manuálně x ASPEC SPE - výtěžnost 109 % 92 % SPE - opakovatelnost 31 % 3 %

64 HPLC aplikace 64 Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation) Extrakt z tuňáka; 0,2 mg/kg; 1 μl nástřik

65 HPLC aplikace 65 Extrakt ze sardinek; 20 mg/kg; 1 μl nástřik Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE) LC/MS CID (collision induced dissociation)

66 HPLC aplikace 66 Pesticidy Rezidua pesticidů ve vzorku salátu Carbendazim – výtěžnost pouze 40%

67 HPLC aplikace 67 Stanovení reziduí pesticidů ve vzorcích papriky

68 HPLC aplikace 68 Karbamáty Nesystémové insekticidy HPLC/FLD Pokolonová derivatizace (OPA/NaOH) Materiál: ovoce, zelenina

69 HPLC aplikace 69 Karbamáty Analýza standardů

70 HPLC aplikace 70 Glyfosát systémový herbicid HPLC/FLD Pokolonová derivatizace Standard

71 HPLC aplikace 71 FUNGICIDY  Extrace z ovoce: dichlormetan Kolona: Nucleosil 7 C18 eluent : 5 g/l kys. mravenčí + NaOH  (pH 7,5) 40 % se 60 % methanolu  1. thiabendazol 2. o-fenylfenol 3. Difenylamin 4. Ethoxychin 5. bifenyl

72 HPLC aplikace 72 PAH HPLC/DAD UV spektrum

73 HPLC aplikace 73 Parametry DAD a FLD stanovení

74 HPLC aplikace 74 LOD: DAD, FLD

75 HPLC aplikace 75 IDENTIFIKACE / KVANTIFIKACE - HPLC/FLD (po GPC přečištění) olej, 10 mg matrice v nástřiku jablka, 250 mg matrice v nástřiku ex/em 216/336 nm


Stáhnout ppt "HPLC aplikace 1 Využití HPLC v analýze potravin. HPLC aplikace 2."

Podobné prezentace


Reklamy Google