Národní fytosanitární workshop “ Současné fytosanitární úkoly a směrování výzkumu v ČR z pohledu výzkumných i ostatních institucí v kontextu s rozvojem spolupráce v EU“ dne Současný výzkum virů a viroidů bramboru Ing. Petr Dědič,CSc. Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o.

Výzkumné projekty NAZV "Bezvirové brambory – eradikace viru S ve šlechtění a množení" ( ) "Bezvirové šlechtění bramboru" ( ) se zabývaly především problematikou udržovacího šlechtění a programy aktivního ozdravování. Výsledky byly podkladem pro zařazení PVS do oficiálních kritérií kontroly zdravotního stavu základních stupňů sadby v posklizňových zkouškách u nás. Významný vliv na stupeň reinfekcí PVS měly především přítomnost infikovaných rostlin v i mimo sledovaný porost, stupeň rezistence odrůd a počet roků expozice materiálu v polních podmínkách. Explantátové kultury a zkrácený cyklus udržovacího šlechtění a množení přineslo výrazné pozitivní výsledky. Výhody těchto postupů nebyly plně využity na úseku šlechtění nových odrůd kde do registračních zkoušek byli přihlašováni kříženci se 100% infekce PVS a vlastní ozdravovací proces byl zahajován většinou až po, nebo těsně před povolením odrůdy.

Navazující projekt 1B53036 Novošlechtění bramboru na bezvirovém základě Doba řešení: 2005 – 2008, byl proto zaměřen výlučně na materiály novošlechtění a zahrnoval prakticky celý rozsah šlechtění nových odrůd bramboru v ČR. V rámci navrhovaných aktivit řešení projektu byly sledovány rozhodující faktory získání a uchování bezvirových materiálů jako je: -úroveň rezistence kříženců k PVS (ale též k některým dalším devastujícím kmenům virů, např. PVY-N), - komplexní systém laboratorní diagnózy virů ze skleníkových a polních výsadeb, -efektivní převody časných generací kříženců do kultury in vitro a jejich aktivní ozdravování v podmínkách in vitro. - aplikace metod molekulární analýzy, jako podklad pro jednoznačnou identifikaci nových gentypů Návrat perspektivních kříženců do zkráceného systému množení byl směrován k zajištění bezvirové hlízové produkce pro registrační zkoušky (RZ).

Souběžně s řešením problematiky viru S bramboru probíhal výzkum viru Y bramboru v těchto projektech: Grantová agentura České republiky Název projektu: Molekulární variabilita izolátů viru Y bramboru (PVY) Registrační číslo projektu: 522/00/227 Řešitelská pracoviště: Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Ústav molekulární biologie rostlin AV ČR České Budějovice Na tomto úseku probíhala rovněž mezinárodní spolupráce s Francií v rámci projektu BARRANDE a následně byl řešen projekt NAZV QC 1167 Identifikace, diferenciace a charakterizace původců nekróz bramboru virové etiologie Řešitelská pracoviště: VÚB Havlíčkův Brod ÚMBR AV ČR Č. Budějovice ÚEB AV ČR Praha Doba řešení: 2001 – 2004 Cíl řešení: Vypracování spolehlivé laboratorní diagnostické a diferenciační metody pro viry bramboru přenosné v půdě a nekrogenní izoláty viru Y bramboru (PVY-NTN), včetně ověření citlivosti a vnímavosti odrůd bramboru k infekci a její vliv na kvalitativní parametry.

PMTV TRV PVY-NTN cv. Hermes Nadine Nicola Kobra

Největší pozornost byla věnována kmenové diferenciaci PVY, které se staly nejzávažnějším virózou bramboru.

PVY-N PVY-O Příznaky infekce PVY na rostlinách tabáku N. tabacum cv. Samsun

Organizace génomu PVY-NTN PVY N 605 P1HC-ProP3CINIaNIbCP 3’ NTR 5’ NTR P1HC-ProP3CINIaNIbCP 3’ NTR PVY O ’ NTR P1HC-ProP3CINIaNIbCP 3’ NTR PVY NTN -H 5’ 5’ NTR NTR PVYN or PVYN- related profiles PVYO or PVYO - related profiles CIP3

PVY N 605 P1HC-ProP3CINIaNIbCP 3’ NTR 5’ NTR P1HC-ProP3CINIaNIbCP 3’ NTR PVY O ’ NTR Organizace génomu PVY-Wilga CP P3CINIaNIb3’NTR PVY N or PVY N - related profiles PVY O or PVY O - related profiles PVY N or PVY N - related profiles PVY O or PVY O - related profiles P1HC-Pro 5’ NTR PVY N W N242 PVY N W N242 HC-Pro PVY N Wi-P PVY N Wi-P CP P3CINIaNIb 3’ NTR 5’ NTR P1

QF 3109 Diferenciace viru S bramboru (PVS) a identifikace karanténně významných izolátů technikami molekulární diagnózy Plánovaná doba řešení: 2003 – 2007 Řešitelé: VÚB Havlíčkův Brod ÚMBR AV ČR České Budějovice Cíl řešení: Detailně charakterizovat kmenové spektrum viru S bramboru pomocí biologických, sérologických a nově vyvinutých, ověřených molekulárních metod a postupů. Předat optimalizované diferenciační postupy státní správě k realizaci na úseku fytokarantény. Příklady aktivit A01/06 Detekce viru S bramboru (PVS) v materiálech génové banky, tuzemských šlechtitelských materiálech a importované sadbě A02/06 Sekvenování fragmentů molekulárního bypassu izolátů PVS-CS a jejich porovnání s genomy PVS-O A03/06 Rozpracování metody molekulární hybridizace pro detekci viru S bramboru A04/06 Diferenciace izolátů PVS na indikátorových rostlinách a molekulárními technikami zaměřenými na vybrané oblasti génomu A05/06 Charakterizace biologických vlastností vybraných izolátů PVS ze skupiny O a CS A06/06 Biolostická infekce směsnými vzorky PVS-CS a PVS-O a vytipování možných rekombinantních klonů.

Výsledky uznávacího řízení sadby v ČR Celkem Zkoušeno Uznáno SestupněnoNeuznáno ČR ha %% ,4 1,06, ,10,74, ,03,2 18, ,82,39, ,43,67, ,33,28, ,83,0 23, ,05,9 23, ,95,0 20,3 Dle údajů ÚKZÚZ

Výskyt virů bramboru ve vzorcích sadby v posklizňových zkouškách (ks pozitivních reakcí ELISA) RokV i r u s PLRVPVYPVA PVX/PVM (PVS) L/Y 7,2% 2007 L/Y 21,2% Podkladové materiály ÚKZÚZ

QH :Variabilita viru svinutky bramboru (PLRV), zvýšení spolehlivosti jeho detekce a uplatnění transgenóze v rezistentním šlechtění Plánovaná doba řešení: – Cíl řešení: Ověření biologické a molekulární variability izolátů PLRV, zvýšení spolehlivosti jeho laboratorní detekce, identifikace a diferenciace. Studium možností uplatnění transgenóze v rezistentním šlechtění bramboru. Aktivity : - Doplnění kolekce izolátů PLRV a jejich charakterizace - Biologické vlastnosti izolátů PLRV - Varianty imunologické diagnózy, spolehlivost detekce - Varianty molekulární diagnózy (RT-PCR) a spolehlivost detekce PLRV - Sekvence vybraných úseků genomu PLRV, návrh hybridizačních sond - Příprava binárního vektoru pro transformaci rostlin a transformace vybraných genotypů bramboru.

Detekce izolátů PLRV pomocí RT-PCR (primery dle Solman et al., 2002) ref Z refhmotnostní standard Z1 negativní kontrola 1.Izoláty PLRV (1/001 – 1/1/045)

R4R8R20R12R13R 19R 15R 18R 21 22R 23 24R 26R Pokrytí genomu PLRV sekvenováním

Návrh binárního vektoru pro transformace bramboru

od roku 2008 se dále podílíme na řešení projektu NAZV QH81262 Riziko zdrojů karanténního viroidu PSTVd pro produkční kultury Solanaceae (brambory a rajčata) v souvislosti s jeho zjištěním v okrasných rostlinách Řešitelské pracoviště: Výzkumný ústav Silva Taroucy pro krajinu a okrasné zahradnictví, v.v.i. Průhonice a Výzkumný ústav bramborářský Havlíčkův Brod, s.r.o. Plánovaná doba řešení: 2008 – 2011 Cíl řešení: Zjistit a vyhodnotit nově vzniklá rizika karanténního viroidu PSTVd pro produkční kultury Solanaceae (brambory a rajčata) v souvislosti s jeho zjištěním v okrasných rostlinách v ČR.

V006:Diagnostika virových onemocnění: - připravit polyklonální protilátky vůči vybraným rekombinantním antigenům kódovaným genomy virových patogenů brambor a testovat jejich využití v diagnostice odpovídajících virových oněmocnění DC6681:Výběr vhodných postupů a syntéza protilátek proti rekombinantním antigenům rostlinných virů. DC6791:Ověření účinnosti protilátek proti rekombinantním antigenům virů bramboru. V rámci projektu Výzkumné centrum 1M06030 (MŠMT) „Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin“ Doba řešení řešíme spolu s ÚEB AV ČR v.v.i. Praha výstup Participujeme dále na výzkumném projektu Akademie věd ČR 1QS : Studium výskytu fytopatogenů a jejich genetických variant Doba řešení Řešitelské pracoviště: Biologické centrum AV ČR, v.v.i. České Budějovice

Výzkumný záměr VÚB MSM Molekulární a technologické základy produkce kvalitních brambor MŠMT ( ) Etapa 01: Vývoj, ověření a uplatnění molekulárních metod detekce a kvantifikace vybraných patogenů a genetických struktur u brambor (q RT-PCR, detekce virů a viroidů (PSTVd), detekce GMO,diagnostické čipy)

NÁVRH PROJEKTU DO VEŘEJNÉ SOUTĚŽE VE VÝZKUMU A VÝVOJI Programu výzkumu v agrárním sektoru s počátkem řešení projektů v roce 2009 na roky poskytovatel - MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ Evideční číslo projektu - přidělí NAZV Podací číslo projektu Vir2 Název projektu Studium výskytu kmenových skupin a variant viru Y bramboru (PVY) v sadbě bramboru v ČR VEŘEJNÁ SOUTĚŽ Programu výzkumu v agrárním sektoru s počátkem řešení projektů v roce 2009 na roky PODPROGRAM EFEKTIVNÍ POSTUPY V AGRÁRNÍM SEKTORU Výzkumný směr Ochrana zdraví rostlin a zvířat Cíl projektu Stanovit frekvenci výskytu kmenů a variant PVY ve šlechtitelských a množitelských materiálech sadby brambor v ČR. Charakterizovat zkoušené odrůdy z hlediska vnímavosti a citlivosti k závažným izolátům nekrotického charakteru. Doba řešení Výsledek přijímacího řízení: NEPŘIJATO 1.Oponent - 'ANO' 2. Oponent - 'ANO' 2. PROGRAMOVÁ KOMISE 'NE' 3. Mze: NE - projekt nebude financován Smlouva nebude uzavřena.

Identifikace zdrojů virové infekce a jejich eliminace ve šlechtitelských materiálech a sadbě bramboru v ČR VS8MZEVAK Programu Výzkum v agrárním komplexu, VAK s počátkem řešení projektů v roce 2009 PODPROGRAM UDRŽITELNÝ ROZVOJ AGRÁRNÍHO SEKTORU Zlepšit biologický potenciál kulturních organismů a způsoby jeho využívání pro efektivní produkci potravin. CÍL PROJEKTU Detekce zdrojů virové infekce ve šlechtitelských a sadbových materiálech, charakterizace kmenového spektra PVY a reakce odrůd na infekci novými izoláty, ověření účinných způsobů ozdravení a zvýšení efektivity rezistentního šlechtění pomocí DNA markerů. Datum zahájení řešení Výsledky projektu Exaktní identifikace zdrojů virové infekce v porostech výchozích šlechtitelských materiálů, základní a certifikované sadbě,charakterizace izolátů viru Y bramboru na úrovni kmene resp. varianty, ozdravení infikovaných materiálů pro potřeby bezvirového šlechtění a aplikace MAS pro efektivní výběr nšl. s vyšší úrovní rezistence proti nejzávažnějším patogenům, zejména PVY.

Výsledek Projekt nesplnil podmínku podle článku 9 Rámce Společenství pro státní podporu výzkumu, vývoje a inovací (zvláštní pravidla pro zemědělství a rybolov) – projekt využívá výjimku pro zemědělství (uchazeč VÚB jako střední podnik využívá vyjímku s 90% dotace, přitom střední podnik může mít maximálně 75% dotace vč. bonusu), avšak žádný uchazeč nedodal čestné prohlášení o splnění 4 podmínek k výjimce pro zemědělství podle Rámce). Dále upozorňujeme, že v návrhu projektu chybí výstup na rok 2011.

VIROBANKA – shromažďování a udržování izolátů virů in vitro Národní program konzervace a využívání genofondu mikroorganismů a drobných organismů hospodářského významu. (Dotační titul) Kolekce izolátů: PLRV-55, PVY-119, PVA-22, PVM-36, PVX-27, PVS-280 Dále: PSTVd, PMTV, TRV, PVV, PAMV, PRDV. Evidence na internetu. Využití: -Bezprostřední zahájení řešení výzkumných projektů. Př. : „Kryoterapie…“ -kontrolní izoláty -mezinárodní výměna