Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

CHARAKTERIZACE DNA. Proč tyto testy provádět? účinnost izolace optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR Konfucius QANTUM = kolik?

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "CHARAKTERIZACE DNA. Proč tyto testy provádět? účinnost izolace optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR Konfucius QANTUM = kolik?"— Transkript prezentace:

1 CHARAKTERIZACE DNA

2 Proč tyto testy provádět? účinnost izolace optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR Konfucius QANTUM = kolik? KVANTIFIKACE QUALIS = jaký? KVALIFIKACE SPECIES = druh SPECIFIKACE

3 Je těžké hledat černou kočku v temné místnosti. Zvláště když tam není.

4 MOLEKULÁRNÍ HMOTNOST MW (dsDNA) = (počet bp) x 660 [Da] MW (ssDNA) = (počet b) x 330 [Da] PŘEPOČET µg ↔ pmol (dsDNA) pmol (dsDNA) = µg (dsDNA) x 1,515 / N (bp) µg (dsDNA) = pmol (dsDNA) x N (bp) x 6, PŘEPOČET µg ↔ pmol (ssDNA) pmol (ssDNA) = µg (ssDNA) x 3,030 / N (b) µg (ssDNA) = pmol (ssDNA) x N (b) x 3, Kvantita - několikero vzorečků

5 Celková DNA6 pg Celková RNA10-30 pg Velikost genomu2 x 3, bp PlazmaErytrocytyLeukocytyTrombocyty Počet v ml krve Obsah DNA v ml krve něco málo… µg- Obsah DNA v buňce Objem2 a více ml koncentrace spermií20 milionů v ml a více Obsah DNA v ml spermatu60 µg a více

6 Kvalita DNA - degradace fragmentacenarušení struktury

7 Kvalita DNA - degradace

8 Kvalita DNA - inhibitory

9 specifita DNA

10 Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie Měříme, kolikrát poklesne intenzita monochromatického světla procházejícího roztokem DNA T λ = I p / I V A λ = -log T λ = ε λ · c · l Lambert – Beerův zákon transmitance absorbance

11 Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie Absorpční maximum DNA λ = 260 nm

12 Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie Pro forenzní použití je ale spektrofotometrie velmi nevhodná… Proč? malá senzitivita (nízké koncentrace nezachytí) nulová specifita (cokoli zvyšuje absorpci při 260 nm, je považováno za DNA) k měření jsou třeba velká množství izolátu

13 MALÉ FYZIKÁLNÍ REWIEW „-SCENCÍ“ LUMINISCENCE CHEMO- TERMO- ELEKTRO- KATODO- SONO- MECHANO- FOTO-

14 FOTOLUMINISCENCE fluorescence fosforescence

15 DETEKCE DNA – interkalační fluorofory Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková tRNA PE, která obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Y t -báze ( em max  470 nm). DNA je tedy jen slabě fluorescentní nebo nefluorescentní.

16 DETEKCE DNA – interkalační fluorofory ethidiumbromidSYBR green

17 Kvantitativní detekce fluoroforů = fluorimetrie PICO Green OLIGO Green

18 detekce specificky lidské DNA Metoda je z logiky věci vždy založena na sekvenční specifitě

19 Kvantifikace specificky lidské DNA - blotting izolát blotujeme na membránu hybridizujeme se specifickou sondou sondu nějak zobrazíme – čím silnější bude signál, tím víc sondy je navázáno, tzn. tím víc cílových sekvencí sonda našla = tím víc DNA α-satelitní DNA sekvence v lokusu D17Z1 QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit

20 Kvantifikace specificky lidské DNA - luminometrie denaturujeme dsDNA na ssDNA hybridizujeme se specifickou sondou přidáme polymerázu s exonukleázovou aktivitou a pyrofosfát – sonda je odbourána, vznikají volné dNTP fosfát je přenesen pomocí kinázy na přidané ADP, vzniká ATP ATP je použito na luminiscenční enzymatickou reakci Alu-repetice (???) AluQuant™ Human DNA Quantitation System

21 real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!

22

23 Detektor Emisní filtr Zdroj světla Excitační Filtr

24 real-time PCR kvantifikace – možné principy nespecifické interkalační fluorofory SYBR green, EtBr hydrolyzační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) hybridizační sondy LightCycler

25 real-time PCR kvantifikace nespecifické interkalační fluorofory provádíme PCR specificky lidského lokusu (např. Alu) současně měříme fluorescenci (v roztoku je SYBR Green či jiná dye) čím více je dsDNA, tím větší je fluorescence je nutno mít ověřenou specifitu amplifikace!!!

26 real-time PCR kvantifikace – Sybr green

27 real-time PCR kvantifikace hydrolyzační sondy hybridizační sondy TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“) LightCycler využívají tzv. FRET = Fluorescent (Förster) Resonance Energy Transfer Dye ADye B λ excitA λ emisA λ excitA λ emisB

28 real-time PCR kvantifikace - TaqMan

29 real-time PCR kvantifikace - maják

30 real-time PCR kvantifikace - štír

31 real-time PCR kvantifikace - LightCycler

32 real-time PCR kvantifikace plató exponenciální fáze CTCT

33 real-time PCR kvantifikace

34

35 real-time PCR kvantifikace mohu měřit i přítomnost inhibitorů – jak? neprovádím monoplex PCR, ale duplex PCR kvantifikovaný lokus kontrolní lokus


Stáhnout ppt "CHARAKTERIZACE DNA. Proč tyto testy provádět? účinnost izolace optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR Konfucius QANTUM = kolik?"

Podobné prezentace


Reklamy Google