Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3. LF UK.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3. LF UK."— Transkript prezentace:

1 Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3. LF UK

2  Krev odebrána do zkumavek EDTA EDTA = kyselina et h ylendiaminotetraoctová  Při odběru krve vyvazuje vápník → nesrážlivá krev (působí podobně jako citrát)  Vyvazování některých dvojmocných kationtů - lék při otravě olovem, rtutí  K vyšetření pro účely NIPD obvykle potřeba 11 ml

3  Proces zpracování krve klíčové, využívána plazma  Množství fetální DNA v plazmě a séru je srovnatelné  Ve srážlivé krvi dochází při koagulaci k destrukci mateřských buněk a uvolnění mateřské DNA → až 15x zvýšené množství → snížení senzitivity analýzy Lo et al., 1998

4

5

6  Klíčové – při použití větší odstředivé síly klesá množství celkové DNA a dle některých studií i množství fetální DNA  Centrifugace 2x při 1200g  Zpracování do 24h odstředivá síla [g], odstředivá síla [g], kolikrát se při odstřeďování znásobí hmotnost částic ↑ poloměru rotoru a rychlosti → ↑g

7  QIAamp DSP Virus kit (Qiagen)  komerční kit, CE-marked  Určeno pro izolaci virových NK (DNA + RNA) z lidské plazmy nebo séra cffDNA je fragmentována (apoptotický trofoblast), hlavní podíl fragmenty bp a bp  Využívá selektivní vazebné vlastnosti membrán na bázi křemíku  Vakuový systém, manuálně  Modifikovaný protokol

8 Metoda QIAamp DSP Virus zahrnuje 4 kroky: 1. L ý z a vzorku (AL pufr, proteáza, inaktivace R N áz, při 56°C) 2. Adsorbce NK na silikagelovou membránu při průchodu lyzátu díky podtlaku 3. Promytí membrány 4. Eluce virových nukleových kyselin z membrány (60 μl AE pufru)

9 Reakční směs: dNTPs, PCR pufr s Mg2+, polymeráza, primery, voda

10

11 DNA/RNA izolace DNA amplifikace (pokud izolace RNA, 1. krok je RT PCR) Elektroforéza

12  Nízká senzitivita a specificita – zásadní pro NIPD  Nízké rozlišení  Pracné, bez automatizace, práce s et h idium bromidem, nutná speciální místnost  Analýza až výsledného produktu amplifikace na elektroforéze → daná sekvence je/není přítomna ALE velmi orientační kvantifikace → PCR v reálném čase

13

14

15  Založena na principu klasické PCR  Umožňuje kvantifikaci sledovaného úseku DNA - záznam každého PCR cyklu ve skutečném čase  Pro záznam amplifikace se využívají sondy (fluorescenční látky), které se váží specificky nebo nespecificky na amplifikovanou DNA Fluorescence PCR cyklus Ct = 1. signifikantní zvýšení PCR produktu (zaznamenáno pomocí zvýšení fluorescenčního záření, koreluje s iniciálním množstvím sledované sekvence

16  Specifická vazba mezi sondou a cílovou sekvencí: TaqMan sondy, MGB sondy, Scorpion, Molecular beacons  Nespecifická vazba: SYBR Green  Riziko falešně pozitivních signálů při nespecifických vazbách, nevhodné pro NIPD

17

18  Vytvoření standardní křivky  DNA o známé koncentraci (měříme na spektrofotometru)

19  Příklad: 42 ng/μl = pg/μl : 6,6 = 6363 kp/μl Spočítáme si, kolik kp/1 PCR jamka Minimálně 3 koncentrace, obvykle desítkové ředění Využití v NIPD: kvantifikace NK (SRY, GLO, RASSF1A) u gravidit s patologickou placentací (PEP, IUGR)

20  Od 10. týdne  U gravidit v riziku výskytu X-vázaných chorob nebo CAH (od 6. týdne, kvůli zahájení terapie)  Konvenční PCR nedosáhla 100% senzitivity a specificity → PCR v reálném čase

21  Amplifikace paternálních alel pomocí real- time PCR SRY gen (sex determining region) -1 kopie DYS 14 gen (TSPY1- testis specific protein) – variabilní počet kopií  100% senzitivita a 100% specificita u detekce SRY genu

22  X–vázaná onemocnění - plody ženského pohlaví (SRY a DYS14 negativní), není nutná CVS a/nebo AMC, pozdější konfirmace UZ  CAH – plody mužského pohlaví (SRY a DYS14 pozitivní), možnost vysadit terapii (dexamethason)  Dexamethason - zabraňuje virilizaci zevního ženského genitálu, nutné podávat od týdne

23  Pacientka v 10. týdnu gravidity  Děti: chlapec, 6 let, CAH  Nyní suspektní CAH u plodu Testování na SRY, GLO systém SRY: 6/6+, je to chlapec GLO: izolace je OK Možnost vysadit Dexamethason GLO SRY

24  Pacientka: přenašečka hemofilie A  Týden gravidity 11+5 Testování na SRY, GLO systém SRY: 0/6+, je to děvče GLO: izolace je OK Pacientka nemusí podstoupit další vyšetření (AMC) GLO

25  U anti-D aloimunizovaných těhotenství v riziku fetální erytroblastózy nebo hemolytického onemocnění novorozence  Od 10. týdne gravidity  RhD negativita – 15% kavkazské populace  Delece genu  Alterace RHD genu (pseudogen RhD ψ, RHD-CE- D fúzní gen)- zamezí expresi kódovaného proteinu – pozor na falešně poz. výsledky u RHD fenotypicky neg. jedinců

26  RHD  (pseudogen) Inaktivní kompletní RHD gen, 37-bp inzerce exon 4 (PCR) předčasné stop kodony v exonu 6, předčasná terminace translace, 0 HON 66% černošské populace, 27,7% Japonců a11% Brazilců  Hybridní RHD-CE-D gen RhD negativní fenotyp: 3´ konec exonu 3 a exony 4-8 RHCE genu, RHD exon 10 +, exon 7 – (PCR) Weak C, VS+, Afričané (3%)

27  Pro spolehlivou RHD genotypizaci – nutné analyzovat více oblastí RHD genu  Nejčastěji kombinace exonu 7 a 10 nebo exonu 7 a 5  Nutné zohlednit etnickou populaci (výskyt alterací RHD genu)

28  U nás - kombinace exonu 7 a 10  100 % specificita a 100 % senzitivita u detekce RHD exon 7 a exon 10  RhD negativní plody u aloimunizovaných těhotenství nejsou ohroženy HON, u pozitivních plodů včasná informace pro klinika

29  Pacientka RhD negativní  Týden gravidity 20+6  Anti-D protilátky v mateřském séru, titr 1:32+ Testování na RHD exon 7 a 10, GLO systém RHD exon 7: 3/3+ RHD exon 10: 3/3 + GLO: izolace je OK Plod je RhD pozitivní, nutné dále pravidelně sledovat Je ohrožen fetální erytroblastózou a HON GLO RhD exon 7 RhD exon 10

30  Pacientka RhD negativní  Týden gravidity 20+6  Anti-D protilátky, titr 1:8+ Testování na RHD exon 7 a 10, GLO systém RHD exon 7: 0/3+ RHD exon 10: 0/3 + GLO: izolace je OK Plod je RhD negativní Není ohrožen fetální erytroblastózou a HON GLO

31  Fetální erytroblastóza a HON – může být způsobena také dalšími antigeny Rh systému → RHCE genotypizace plodu u anti-c, anti-E a anti-C aloimunizovaných těhotenství

32  Amplifikace paternálních alel pomocí real- time PCR  C/c a E/e polymorfismus - nukleotidové substitucemi a inzerce v RHCE genu Ser103Pro polymorfismus (SNP v exonu 2) pro Rhc Pro226Ala polymorfismus (SNP v exonu 5) pro RhE 109 bp inzerce v intronu 2 pro RhC

33 exon 2 (Rhc) intron 2 (RhC) exon 5 (RhE/Rhe)

34  100 % specificita a 100 % senzitivita u detekce RHD exon 7 a exon 10, RHCE (C alela)  100 % specificita a 95 % senzitivita u RHCE (c alela a E alela) genotypizace (SNP), někdy problém - většina DNA je mateřského původu  RhcCE negativní plody u aloimunizovaných těhotenství nejsou ohroženy HON, u pozitivních plodů včasná informace pro klinika

35  Pacientka RhE negativní (ee fenotyp)  Týden gravidity 20+6  Anti-E protilátky, titr 1:16+ RHE: 6/6+ GLO: izolace je OK Plod je RhE pozitivní, nutné dále pravidelně sledovat Ohrožení fetální erytroblastózou a HON GLO RHE


Stáhnout ppt "Prof. RNDr. Ilona Hromadníková, PhD. Oddělení molekulární biologie a patologie buňky, 3. LF UK."

Podobné prezentace


Reklamy Google