Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Genotypizace plodu Štolba P., Masopust J. Krajská zdravotní, a.s. Masarykova nemocnice, o.z. Transfuzní oddělení.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Genotypizace plodu Štolba P., Masopust J. Krajská zdravotní, a.s. Masarykova nemocnice, o.z. Transfuzní oddělení."— Transkript prezentace:

1 Genotypizace plodu Štolba P., Masopust J. Krajská zdravotní, a.s. Masarykova nemocnice, o.z. Transfuzní oddělení

2 Genotypizace krevních skupin plodu využitelné při HON využitelné při HON genotyp lze stanovit u systémů genotyp lze stanovit u systémů RH (D, c, E) RH (D, c, E) Kell (K) Kell (K) Kidd (Jk a ) Kidd (Jk a ) Duffy (Fy a ) Duffy (Fy a ) největší význam genotypizace RHD největší význam genotypizace RHD

3 Zdroje fetální DNA – rizika odběru Invazivní a riskantní výkony Invazivní a riskantní výkony amniové fibroblasty – při amniocentéze amniové fibroblasty – při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů, 17% riziko FMH 0,5-1% riziko spontánních potratů, 17% riziko FMH choriové klky choriové klky 0,5-1% riziko spontánních potratů, nízké riziko FMH 0,5-1% riziko spontánních potratů, nízké riziko FMH fetální krevní buňky – při kordocentéze fetální krevní buňky – při kordocentéze vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vysoké riziko aloimunizace matky vysoké riziko aloimunizace matky

4 Zdroje fetální DNA – rizika odběru Neinvazivní výkony Neinvazivní výkony fetální buňky v mateřské periferní krvi fetální buňky v mateřské periferní krvi neuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněk neuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněk technologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněk technologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněk volná (nebuněčná) fetální DNA volná (nebuněčná) fetální DNA fetální DNA z plazmy matky fetální DNA z plazmy matky množství fet. DNA stoupá v průběhu těhotenství množství fet. DNA stoupá v průběhu těhotenství abnormálně vysoké hladiny fet. DNA u patologických těhotenství abnormálně vysoké hladiny fet. DNA u patologických těhotenství

5 Volná fetální DNA volná fet. DNA rozptýlená v plazmě matky volná fet. DNA rozptýlená v plazmě matky koncentrace se postupně zvyšuje koncentrace se postupně zvyšuje I. trimestr do 3 % I. trimestr do 3 % III. trimestr až 6 % fet. DNA po porodu rychle mizí z cirkulace fet. DNA po porodu rychle mizí z cirkulace po císařském řezu za 4 – 30 min. po císařském řezu za 4 – 30 min. po vaginálním porodu za 10 – 100 hodin po vaginálním porodu za 10 – 100 hodin

6 Odběr periferní krve matky odebírá se min. 6 ml perif. krve matky odebírá se min. 6 ml perif. krve matky termíny odběru je vhodné navázat na již existující schémata – gynekologická, genetická termíny odběru je vhodné navázat na již existující schémata – gynekologická, genetická určení krevní skupiny matky – 12. týden určení krevní skupiny matky – 12. týden riziko nedostatečného množství fetální DNA riziko nedostatečného množství fetální DNA biochemický screening (MS AFP) – týden biochemický screening (MS AFP) – týden většinou dostačující množství fetální DNA většinou dostačující množství fetální DNA termín pro určení genotypu je do týdne termín pro určení genotypu je do týdne

7 Izolace volné fetální DNA odběr periferní krve matky odběr periferní krve matky do 24 hod. odstranění buněčných elementů do 24 hod. odstranění buněčných elementů opakovanou centrifugací se odstraní veškeré buňky opakovanou centrifugací se odstraní veškeré buňky izolace volné nebuněčné DNA izolace volné nebuněčné DNA izolace doporučenou dg. soupravou / automatem izolace doporučenou dg. soupravou / automatem izolace veškeré volné DNA izolace veškeré volné DNA DNA plodu tvoří cca 2 – 6 % z celkové volné DNA DNA plodu tvoří cca 2 – 6 % z celkové volné DNA izolace dostatečného množství DNA pro min. 4 PCR izolace dostatečného množství DNA pro min. 4 PCR okamžitá analýza vzorku / zamrazení vzorku okamžitá analýza vzorku / zamrazení vzorku

8 Protokoly genotypizace RHD genu gen RHD obsahuje 10 exonů, část sekvencí shodná s RHCE genem gen RHD obsahuje 10 exonů, část sekvencí shodná s RHCE genem více různých protokolů – detekce exonů více různých protokolů – detekce exonů exony 7 a 10 – Roullilac 2007, Hromadníková 2003 exony 7 a 10 – Roullilac 2007, Hromadníková 2003 exony 4, 5 a 10 – Daniels 2004, Minon 2005, 2007 exony 4, 5 a 10 – Daniels 2004, Minon 2005, 2007 exony 5 a 10 – Christiansen 2007 exony 5 a 10 – Christiansen 2007 exony 5 a 7 – Grootkerk 2006, Legler 2007 exony 5 a 7 – Grootkerk 2006, Legler 2007 exony 4 a 7 – Singleton 2000 exony 4 a 7 – Singleton 2000 komerční kity komerční kity Devyser RHD kit (čeká na udělení CE-IVD) - exon 4 Devyser RHD kit (čeká na udělení CE-IVD) - exon 4

9 Protokoly genotypizace RHD genu doporučení testovat nejméně 2 exony (kontrola) doporučení testovat nejméně 2 exony (kontrola) kombinace exonů 7 a 10 je v současnosti otestovaná k použití v ČR (doc. Hromadníková) kombinace exonů 7 a 10 je v současnosti otestovaná k použití v ČR (doc. Hromadníková) kombinace jiných exonů je v ČR též použitelná kombinace jiných exonů je v ČR též použitelná u kombinace exonů 5 a 7 lze u černošské populace detekovat pseudogen RHDΨ (hlavní D-negativní alela Afričanů) u kombinace exonů 5 a 7 lze u černošské populace detekovat pseudogen RHDΨ (hlavní D-negativní alela Afričanů) v ČR je zatím tato minorita zanedbatelná v ČR je zatím tato minorita zanedbatelná

10 Metodika genotypizace RHD genu amplifikace fetální DNA amplifikace fetální DNA metoda real-time PCR metoda real-time PCR specifické značené hydrolizační sondy specifické značené hydrolizační sondy kvantitativní metoda kvantitativní metoda umožňuje odlišení mateřské a fetální DNA umožňuje odlišení mateřské a fetální DNA

11 Taqman sondy - FRET  sonda obsahuje fluorochrom (F) a zhášeč (Q)  exonukleázová aktivita (5´  3´) Taq polymeráza uvolňující fluorochrom  volný fluorochrom emituje záření  záření flourochromu je zachyceno přístrojem a zpracováno

12 PCR zkumavka blok PCR cycleru vzorek čočka real-time PCR PCR v reálném čase – měření intenzity fluorescence při narůstajícím množství PCR produktu záření

13 RHCE a Kell genotypizace plodu RHCE genotypizace RHCE genotypizace detekce oblasti exonu 2 (alela c) detekce oblasti exonu 2 (alela c) detekce oblasti exonu 5 (alela E) detekce oblasti exonu 5 (alela E) nelze vyšetřit pokud těhotná má některou z variant nelze vyšetřit pokud těhotná má některou z variant Kell genotypizace Kell genotypizace detekce SNP z exonu 6 detekce SNP z exonu 6 zatím nelze použít dříve než ve 20. týdnu (v případě malého množství fetální DNA hrozí riziko falešných negativit) zatím nelze použít dříve než ve 20. týdnu (v případě malého množství fetální DNA hrozí riziko falešných negativit)

14 Interní kontroly interní kontroly amplifikace interní kontroly amplifikace amplifikační kontroly (β-globin) amplifikační kontroly (β-globin) kontrola fetální DNA – plod mužského pohlaví (SRY) kontrola fetální DNA – plod mužského pohlaví (SRY) testování 8 polymorfismů inzercí a delecí ve vybraných lokusech – chybí v mateřské DNA testování 8 polymorfismů inzercí a delecí ve vybraných lokusech – chybí v mateřské DNA univerzální markery fetální DNA univerzální markery fetální DNA fetální hypermetylované sekvence – gen RASSF1A fetální hypermetylované sekvence – gen RASSF1A fetální hypometylované sekvence – gen SERPIN B fetální hypometylované sekvence – gen SERPIN B

15 Výhody x nevýhody vyšetření + vyšetření genotypu (RHD) plodu s použitím volné nebuněčné fet. DNA je NEINVAZIVNÍ + vysoká specificita (>99,1 %) a senzitivita (>99,5 %) vyšetření - riziko falešné negativity (i při použití fetálního markeru) - u D w těhotných nelze určit RHD genotyp plodu - nemusí vždy souhlasit s fenotypem (mutace, přestavby genů)

16 Děkuji za pozornost Děkuji za pozornost a hezký zbytek dne a hezký zbytek dne


Stáhnout ppt "Genotypizace plodu Štolba P., Masopust J. Krajská zdravotní, a.s. Masarykova nemocnice, o.z. Transfuzní oddělení."

Podobné prezentace


Reklamy Google