Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Izolace RNA z živočišné tkáně MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Izolace RNA z živočišné tkáně MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU."— Transkript prezentace:

1 Izolace RNA z živočišné tkáně MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

2 Zdroj RNA Čerstvá tkáň živočišného původu –Slezina, játra, ledviny laboratorního potkana

3 Uchování a transport biol. materiálu Ihned po odběru bude následovat izolace zahájená homogenizací a lýzou vzorku. Lyzační pufr blokuje RNA-ázy. Některé postupy doporučují uchovávat lyzáty pro pozdější izolaci.

4 Charakter zpracovávaných tkání Buněčnost – u jater, sleziny i ledvin vysoká – max. 25μg na jednu kolonku Přítomnost lipidů – nízká Charakter extracelulární matrix – snadno mechanicky rozrušitelná

5 Homogenizace tkání Použijeme rotor stator homogenizátor

6 Izolace nukleových kyselin Použijeme RNeasy kit fy QIAGEN

7 Kolonky Qiagen buněčný lyzát centrifugacepromytí a uvolnění

8 Izolační kolonky

9 Izolace RNA 28S 18S 1,5% agaróza vTBE

10 Spektrofotometrické stanovení Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica) A 260 – absorbance vlastní NA A 230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA) A 280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin) A 320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.

11 Odstranění RNA-áz DEPC diethyl pyrocarbonate Karcinogen Deaktivovatelný při 100 st.C

12 Vlastní postup Před prvním použitím nachystat roztoky. –Přidat čistý % ethanol k RPE pufru –Přidat β-merkaptoethanol k RLT pufru v poměru 10 μl na 1 ml pufru. Pozor po smíchání zůstává stabilní pouze 1 měsíc.

13 Vložit vzorek tkáně (20-25 μg) do 1,5 nebo 2 ml eppendorfky a přidat 600 μl RLT pufru. Okamžitě homogenizovat pomocí rotor stator homogenizátoru. Centrifugovat 3 minuty při maximálních otáčkách a supernatant přenést do nové zkumavky.

14 Přidat stejný objem 70% ethanolu a promíchat opakovaným nasátím pipetou. 700 μl vzorku přenést na kolonku vloženou do sběrací zkumavky. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. Možno nanést zbytek vzorku (max. 700 μl na jednu centrifugaci) a zopakovat postup Nanést na kolonku 700 μl pufru RW1 Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku.

15 Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 2 min. při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a vyměnit sběrací zkumavku. Centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g s čistou sběrací zkumavkou-snaha odstranit veškerý ethanol. Kolonku vložit do 1,5 ml zkumavky. Nanést 50 μl RNase free water na střed membrány a centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g. Při očekávaném výtěžku vyšším než 30 μg možno eluci zopakovat. Část eluátu nanést na agarové ELFO, část změřit na spektrofotometru. RNA uskladnit při -80 °C.


Stáhnout ppt "Izolace RNA z živočišné tkáně MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU."

Podobné prezentace


Reklamy Google