Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Transkriptom. Analýzy toku informací v buňce DNA (Genom) pre-mRNA mRNA mRNA (Transkriptom) Proteiny (Proteom) Metabolity (Metabolom) Regulace Jádro Cytoplasma.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Transkriptom. Analýzy toku informací v buňce DNA (Genom) pre-mRNA mRNA mRNA (Transkriptom) Proteiny (Proteom) Metabolity (Metabolom) Regulace Jádro Cytoplasma."— Transkript prezentace:

1 Transkriptom

2 Analýzy toku informací v buňce DNA (Genom) pre-mRNA mRNA mRNA (Transkriptom) Proteiny (Proteom) Metabolity (Metabolom) Regulace Jádro Cytoplasma Chromatografie Hmotová spektrometrie NMR DNA arraye a čipy (semi) qRT-PCR Northern blot + hybrid. Transkripční fúze Funkční genomika 2D elektroforéza Hmotová spektrometrie Proteinové sekvenování Translačí fůze Immunodetekce Enzymové aktivity, … Genomové mapování Genomové sekvenování Anotace genomu Strukturní genomika

3 Transkriptom

4 - soubor všech mRNA přítomných v dané buňce, pletivu, … - odráží míru transkripce genů, alt. sestřih a stabilitu transkriptů Transkriptomika – sledování exprese populací genů, - hledání rozdílů v celkové genové expresi (za různých podmínek, v různých stádiích vývoje, v různých orgánech, …)

5 Sledování transkripce genů – hladiny mRNA (nejen transkriptomicky) DNA (Genome) mRNA (Transkriptom) Proteiny (Proteom) Microarrays/Chips Transkripční fúze promotoru s reportérovým genem Macroarrays Real time PCR qRT-PCR; Semikvant. RT-PCR P T P gen T Hybridizace na Northern blotu reportérový gen Metody založené na hybridizaci NK (na pevné fázi) Metody založené na PCR

6 qRT-PCR a Semikvantitativní RT-PCR množství produktu (počet cyklů potřebných k dosažení určité koncentrace) odráží množství výchozího templátu qRT-PCR Izolace celkové RNA (mRNA) Reverzní transkripce (oligoT či spec. reverze primer) Semikvantitativní RT-PCR cDNA omezený počet cyklů - zastavení v exp. fázi

7 qReal Time - PCR Detekce množství produktu – zpravidla detekce celkové dsDNA - vyšší specifita při použití sond komplementárních k amplifikované sekvenci R …reporter Q …quencher (zhášeč) D … donor A … acceptor

8 Detekce nukleových kyselin hybridizací (na pevné fázi x in situ, … ) sonda (proba) = vlákno NK o známé sekvenci využívané k detekci přítomnosti komplementárních NK v analyzovaném vzorku (směsi izolovaných NK) Hybridizace – interakce komplementárních ssNK – ssNK vázané na pevné membráně (skle) tzv. imobilizovaná (vázaná) fáze – ssNK v roztoku – tzv. mobilní fáze

9 Typy značení - radioaktivní (nejčastěji 32 P) - fluorescenční značení - digoxygenin, biotin apod. + následná detekce protilátkou/streptavidinem Značené sond (směsí NK) pro hybridizace - vlákno se zpravidla značí při syntéze, inkorporací značeného nukleotidu

10 Hybridizace na Northern blotech Imobilizovaná (vázaná) fáze – analyzovaná směs nukleových kyselin Mobilní fáze = značená sonda (detekce přítomnosti/množství jedné sekvence + informace o velikosti sekvence) x hybridizace na DNA čipech (arrayích) Imobilizovaná (vázaná) fáze – lokalizovaně vázané sondy (úseky DNA o známé sekvenci) Mobilní fáze = značená směs analyzovaných nukl. kyselin (detekce přítomnosti/množství velkého počtu sekvencí)

11 Hybridizace na Northern blotu Macroarrays Izolace RNA Rozdělení na elektroforéze Přenos RNA z gelu na membránu - blotování Hybridizace se značenou sondou v roztoku, detekce

12 Fluorescenční (RI) signál Pozice Identita Síla signálu Množství DNA arraye a DNA čipy - princip Array, Čip (imobilizovaná sonda) Fluorescenčně (RI) značené analyzované NK (mobilní fáze) Hybridizace

13 Definice pojmů: array, čip Macroarray (High Density Array) Příprava Podklad Hustota [probes/cm 2 ] Nanášení oligo- nucleotidů nebo PCR fragmentů Membrána max. 64 Microarray např. sklo až 10 4 Chip Přímá syntéza na podkladu (fotolitografie) např. sklo až 2.5 *10 5 Nanášení oligo- nucleotidů nebo PCR fragmentů

14 Arraye Próby PróbyPróby cDNA (EST) Genomové sekvence Oligonukleotidy, … Mobiní fáze (nejčastěji značená cDNA) Imobilizovaná fáze (array)

15 Příprava mikroarrayí nanášením - contact printing Hustota: až 6400 prób na cm 2 na až 108 sklíčkách oligonukleotidy a DNA fragmenty až 12 kb MicroGrid II (Biorobotics) až 64 jehlový nástavec (Telechem) 4.5 mm

16 vzorek II vzorek I Izolace RNA Značení (např. při syntéze cDNA) Hybridizace se směsí Porovnávání genové exprese na mikroarrayích pomocí diferenciálního značení Alternativa: nezávislé hybridizace a porovnání arrayí

17 Identifikace diferenciálně exprimovaných genů - statistické hodnocení odlišnosti

18 1.Nespecifické (cross-) hybridizace, pozadí 2.Absolutní intenzita signálu závislá i na sekvenci (účinnosti hybridizace), nejen na množství komplementární NK 3.Reprodukovatelnost Problémy při použití arrayí každá próba na více pozicích na čipu více prób od každého genu čipy Affimetrix Řešení:

19 Oligonukleotidový čip Affymetrix -více prób na každý gen (např. 20 párů) – složitá pravidla pro navrhování, složení a výběr sekvencí, syntéza přímo na čipu - próby z 3' konce genů (vhodné pro Eukaryota) Syntéza – využívá fotolithografii

20 Oligonukleotidový čip Affymetrix - každý oligonukleotid v přesné verzi a s jedním změněným nukleotidem mRNA sekvence Dokonale párující oligo Chybně párující oligo Sekvence genu Páry DNA prób Buňky s dokonalým párováním Buňky s chybným párováním Záznam intenzity fluorescence Rozdíl v intenzitě fluorescence mezi „dokonale párující buňkou” a „chybně párující buňkou” je analyzován pro všechny dvojice prób - páry s nízkou informační hodnotou 5‘ 3‘

21 Značení sondy pro čipy Affymetrix AAAAAAAAA mRNA AAAAAAAAA TTTTTTTTTT- T7 promoter cDNA s T7 promoterem reverzní transkripce UUUUUUUUU B B B B B B B B B B B B B B B B biotinem značená cRNA in vitro transkripce B B B B B B B B B B B B B B B B B B B RNA pro hybridizaci s čipem fragmentace Celková RNA nebo polyA mRNA je reverzně transkribována na cDNA a lineárně amplifikována in vitro transkripcí do cRNA (za současného naznačení biotinem) připojení T7 promotoru

22 Čipy Affymetrix - hybridizace a analýza výsledku B BBBB B B B B B B B B B B B B B B značení streptavidin- phycoerythrinem B B B B B B B B B B detector promytí a nasnímání excitace při 488 nm emise při 570 nm monochromatický obraz pseudokolorovaný obraz analýza obrazu Po hybridizaci je na biotin navázán konjugát streptavidinu s phycoerythrinem a je nasnímána a analyzována intenzita fluorescence B

23 Genevestigator https://www.genevestigator.com přístup k čipovým datům - analýzy exprese jednotlivých genů např. Arabidopsis - výběr organismu - výběr genu(ů) - výběr čipů (experimentů)


Stáhnout ppt "Transkriptom. Analýzy toku informací v buňce DNA (Genom) pre-mRNA mRNA mRNA (Transkriptom) Proteiny (Proteom) Metabolity (Metabolom) Regulace Jádro Cytoplasma."

Podobné prezentace


Reklamy Google