Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek."— Transkript prezentace:

1 SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

2  detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení  detekce po izolaci a následné separaci proteinů - SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného) Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod:

3 METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce F-aktinu, G-aktinu a DNA  F-aktin: phalloidin konjugovaný s TRITC  G-aktin: DNáza I konjugovaná s Alexa Fluor 488  DNA: DAPI  použité buňky – buněčná linie NES2Y (lidské  -buňky Langerhansových ostrůvků)

4 Fixace – první krok přípravy vzorku  brání rozkladu a autolýze tkáně  cíl - zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín)  vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni  rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet  tkáň se stává rigidnější (snazší manipulace)

5 Pracovní postup: fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS inkubace buněk s phalloidinem-TRITC a DNázou I-Alexa Fluor 488 odstranění nevázaného phalloidinu-TRITC a DNázy I-Alexa Fluor 488 pomocí opakovaného promytí v PBS barvení DNA pomocí DAPI pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

6 METODA 2: Porovnání zastoupení aktinu v různých typech tkání pomocí metody SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného) Izolace proteinů z různých typů tkání  použité typy tkání:  sval  srdce  játra

7 Izolace proteinů z tkáně:  chemickým (používáme v našich experimentech)  mechanickým  fyzikálním  prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk  dezintegrace (lýza) buněk působením:

8

9 Izolace proteinů  přenos tkáně do zkumavky s  dezintegrace buněk pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát)  oddělení směsi proteinů od nezlyzované tkáně centrifugací  pomocí metody podle Bradfordové  použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu nezbytného pro vytvoření kalibrační křivky Stanovení koncentrace proteinů Pracovní postup:

10 Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE  povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícím SDS  nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinů na polyakrylamidový gel  separace proteinů pomocí vertikální elektroforézy Identifikace proteinů  barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku Coomassie Brilliant blue  lokalizace aktinu a ostatních proteinů v gelu, porovnání míry exprese v jednotlivých tkáních  chemiluminiscenční detekce aktinu (pouze demonstrace)

11 Stanovení koncentrace proteinů  používány různé metody  všechny uvedené metody jsou založené na spektrofotometrickém stanovení (měření absorbance) metoda podle Bradfordové (námi použitá metoda) Lowryho metoda BCA metoda (Bicinchoninová metoda) stanovení z UV spektra, atd.

12  příprava standardů pro sestavení kalibrační rovnice – několik vzorků proteinu o známé koncentraci (jako standard obvykle používán bovinní sérový albumin = BSA)  naředění lyzátu (koncentrace v rozsahu kalibrační přímky)  inkubace standardů a našich vzorků o neznámé koncentraci s činidlem Bradfordové  změření absorbance (A595 nm)  konstrukce kalibrační přímky  zjištění koncentrace proteinů v lyzátu výpočtem z rovnice kalibrační křivky Stanovení koncentrace proteinů metodou podle Bradfordové

13 Princip metody Bradfordové  kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny  Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (arginin (ARG), fenylalanin (PHE), tryptofan (TRY) a prolin (PRO))

14 Coomassie Brilliant Blue  po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou  detekce při 595 nm

15 Kalibrační křivka

16 Lowryho metoda  založená na detekci některých aminokyselin (tyrosin a tryptofan)  modré zabarvení roztoku (v závislosti na zastoupení obou aminokyselin ve vzorku) je detekováno při nm

17 Stanovení z UV spektra  stanovení koncentrace proteinů pomocí absorpce v UV spektru ( nm)  závislé na přítomnosti aromatických aminokyselin v proteinech (tyrosin a tryptofan)  [Protein] (mg/mL) = 1.55*A *A 260

18 BCA metoda  BCA = bicinchoninic acid  barevná reakce založena na interakci s peptidovou vazbou  purpurové zbarvení detekovatelné při 562 nm


Stáhnout ppt "SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek."

Podobné prezentace


Reklamy Google