Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Biochemické metody separace proteinů. Charakterizace proteinu 1.Molekulová hmotnost celého proteinu 2.Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců 3.Určení.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Biochemické metody separace proteinů. Charakterizace proteinu 1.Molekulová hmotnost celého proteinu 2.Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců 3.Určení."— Transkript prezentace:

1 Biochemické metody separace proteinů

2 Charakterizace proteinu 1.Molekulová hmotnost celého proteinu 2.Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců 3.Určení primární struktury 4.Aminokyselinové složení 5.Aminokyselinové sekvence 6.Trojrozměrná struktura 7.Izoelektrický bod proteinu 8.Spektroskopické vlastnosti

3 A.Separace založené na velikosti molekul (dialýza a ultrafiltrace, centrifugace v hustotním gradientu, gelová filtrační chromatografie) B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů (izoelektrická precipitace, vysolování neutrálními solemi, frakcionace organickými rozpouštědly) C. Separace založené na základě elektrického náboje (elektroforetické metody, iontově výměnná chromatografie, afinitní chromatografie) Separační metody

4 A. Separace založené na velikosti molekul Dialýza a ultrafiltrace Koncentrační gradient částic s povrchovým nábojem Propustnost membrány pro rozpuštěné látky Velikost povrchu membrány Pohyb částic < 1000 Da

5

6 Centrifugace v hustotním gradientu Lineární hustotní gradient (sacharóza, CsCl) centrifugace při vysokých otáčkách (150 tis. g) sedimentace proteinů určitou rychlostí podle velikosti, hustoty, tvaru molekul ( je dosažena rovnováha mezi hustotou roztoku a částicí ) po centrifugaci jsou proteiny v gradientu rozděleny a zahuštěny

7

8 Chromatografie

9 Hydrofilní gelové částice (polymer) Uvnitř každé částice jsou póry Látky se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti) Gelová filtrační chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie)

10 Určení molekulové hmotnosti z kalibrační křivky Kalibrační křivka Jednotlivé frakce proteinů se detekují spektrofotometrem. Rychlost průtoku proteinu je úměrná velikosti molekuly.

11 Optimální vlastnosti gelu pro gelovou filtraci: inertní matrice vůči děleným složkám i elučním roztokům chemická stabilita během několika kroků, při různém pH a při různé teplotě mechanická stabilita při vyšším tlaku (nesmí se deformovat) optimální velikost gelových částic (příliš malé částice - rozdělení je přesnější, ale pomalejší a naopak)

12 rozpustnost globulárních proteinů ovliňuje pH při pH = pI je rozpustnost nejnižší, molekuly mají tendenci se shlukovat – mají 0 náboj protein má celkový povrchový náboj buď kladný nebo záporný (NH 3 + nebo COO - postranních řetězců aminokyselin v proteinu) princip izoelektrické precipitace - každý protein má jiné pI a vysráží se ze směsi proteinů v roztoku, který má pH = jeho pI. B. Separace založené na rozdílech rozpustnosti proteinů Izoelektrická precipitace náboj proteinu pI pH roztoku je nižší pH roztoku je vyšší +- náboj proteinu

13 Rozpustnost proteinu prudce stoupá: pH roztoku < pI proteinu pH roztoku > pI proteinu

14 Vysolování proteinů neutrálními solemi Princip Hydrofilní aminokyseliny interagují s molekulami vody a vytvářejí s ní vodíkové můstky (čím více hydrofilních skupin, tím více je protein rozpustný)  Přidání soli do roztoku odebírá proteinu vodní plášť  Interakce protein/protein je silnější než protein/roztok  Molekuly proteinu koagulují díky hydrofóbním interakcím

15 Vyšší koncentrace neutrální soli (NaCl, KCl) ovlivňuje rozpustnost globulárních proteinů. Povaha aniontu (Cl - ) se ve vysolovacím efektu uplatňuje více než povaha kationtu Na + ). Dvojmocné a vícemocné anionty jsou účinnější než jednomocné anionty - MgCl 2 a (NH 4 ) 2 SO 4 více než NaCl. Při vysoké iontové síle se protein kompletně vysráží (mezi 39 a 75 %).

16 etanol sníží dielektrickou konstantu (nižší než voda) (dielektrická konstanta - polarita rozpouštědla) sníží se stupeň ionizace a zvýší přitažlivé síly mezi opačnými náboji, tím se sníží rozpustnost. udržováním roztoku při teplotách kolem 0 o C se snižuje nebezpečí denaturace proteinu. Frakcionace (rozdělení) proteinů organickými rozpouštědly

17 Metody vycházejí z acidobazického chování proteinů (typ a počet ionizovatelných skupin aminokyselin) Elektroforetické metody Dělení látek s odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při elektroforéze dělí nabité molekuly (ionty): při pH > pI - protein je aniontem, má celkový (-) náboj – pohyb k anodě při pH < pI - protein je kationtem, má celkový (+) náboj – pohyb ke katodě C. Separace na základě elektrického náboje

18 Proužek acetátcelulózy – nanesení vzorku. Elektroforéza ( rozdělení podle různých elektroforetických pohyblivostí). Rozdělené proteiny na zóny. Densitogram (densita je přímo úměrná koncentraci) Zónová elektroforéza (dělení plasmatických bílkovin)

19 Iontově výměnná chromatografie Proteiny se pohybují kolonou rychlostí, která je dána jejich celkovým náboj v roztoku o daném pH. pH a obsah solí mobilní fáze, která obklopuje molekuly proteinů ovlivní jejich ionizaci. Syntetický polymer (např. pryskyřice) obsahuje nabité funkční skupiny:  záporně nabité kuličky – katexy (vazba kationtů)  kladně nabité kuličky – anexy (vazba aniontů) Katex zadržuje kladně nabité částice, záporně nabité se pohybují s rozpouštědlem (mobilní fází). Navázané proteiny se z vazby uvolní změnou iontové síly nebo změnou pH roztoku protékajícího chromatografickou kolonou

20 D. Separace pomocí specifického ligandu Využití biologických vlastností proteinů - specifická nekovalentní vazba s jinou molekulou (ligand) Afinitní chromatografie

21 enzym + koenzym hormon + receptor antigen + protilátka inhibitor+substrát lektin+cukr použití nosiče - agarózové partikule (Sephadex)

22 Gelová elektroforéza Gel polyakrylamidu nebo agarózy. Molekuly se dělí podle své velkosti (malé rychleji, velké pomaleji). SDS polyakrylamidová gelová elektroforéza SDS, sodium dodecyl sulfate, dodecyl síran sodný – iontová povrchově aktivní látka


Stáhnout ppt "Biochemické metody separace proteinů. Charakterizace proteinu 1.Molekulová hmotnost celého proteinu 2.Molekulová hmotnost polypeptidových řetězců 3.Určení."

Podobné prezentace


Reklamy Google