Isolace enzymů.

Prezentace na téma: "Isolace enzymů."— Transkript prezentace:

1 Isolace enzymů

2 Proč isolovat enzymy? Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy  degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory  snížení aktivity cílových enzymů) V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina  urokinasa, streptokinasa ...)

3 Zdroje enzymů Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu ...) Selekce bakteriálních producentů amylas

4 Bakterie, kvasinky, plísně, řasy
Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru ...) - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou)

5 Živočišné zdroje Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci
Jateční zvířata – orgány, krev Člověk – tělní tekutiny (krev  plasmin, thrombin ...; moč  urokinasa ...) Bezobratlí (hmyz, plži, mlži  málo se využívají)

6 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za
definovaných podmínek

7 Problémy se vzorkem Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek) Malá množství cílového enzymu Labilita enzymu

8 Zásady pro práci s biologickým materiálem
Pokud možno zpracovat co nejdříve V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 oC) Rozmrazování – co nejrychleji Nízká teplota při isolaci Vhodné pH + iontová síla Vhodná koncentrace bílkoviny Zabránění pěnění Omezení nežádoucí proteolytické aktivity Přídavek specifických látek (např. merkaptoethanol, EDTA ...)

9 Cíl izolace Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity
Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného (optimálního) úsilí

10 Distribuce enzymů Intracelulární V periplasmatickém prostoru
Extracelulární cytoplasma periplasma

11 Membránově vázané bílkoviny

12 Úprava biologického materiálu
Mletí (kulový mlýnek, masový strojek) Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru) - Elvehjem-Potterův homogenizátor - třecí miska s pískem - výkonný mixer

13 Dezintegrace mikrobiálních buněk
Narušení buněčné stěny Způsoby – fyzikální - chemické - enzymové

14 Fyzikální způsoby dezintegrace
Třecí miska + balotina, písek ... Střídavé zmražování a roztávání French press (protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) Ultrazvuk Mlýnek se skleněnými balotinami X-press

15 Chemické způsoby dezintegrace
Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu) Osmotická lyse  erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí) Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány) Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 oC fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)

16 Enzymové způsoby dezintegrace
Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)  rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G+), následné zředění destilovanou vodou

17 Metody isolace enzymů Srážení (precipitace)
Membránové separační procesy Chromatografie Elektroforéza

18 Srážení Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH4)2SO4 Filtrace nahrazena centrifugací

19 Vysolování vsolování vysolování

20 (NH4)2SO4 Rozpustnost se málo mění s teplotou
Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3) Levný Stabilizuje bílkoviny Relativně čistý

21 Srážení - dvojstupňově

22 Provedení pevný (NH4)2SO4 nebo saturovaný roztok (NH4)2SO4 Chlazení
Míchání 10-30’ Centrifugace úprava pH NH4OH El. míchačka

23 Srážení organickými rozpouštědly
Kompletně mísitelné s vodou Nereagují s bílkovinou Musí mít dobrý precipitační efekt Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!! Možné dvoustupňové srážení EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

24 Srážení organickými polymery a sloučeninami
Princip identický jako srážení s rozpouštědly DEAE dextran PEG Polyakrylová kyselina Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát) Kaprylová kyselina

25 Srážení selektivní denaturací
Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z % v nativním stavu. Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat

26 Tepelná denaturace Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

27 Membránové separační metody
Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

28 Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

29 Odstranění nízkomolekulárních složek
Dialýza

30 Chromatografické metody – základní rozdělení
Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a stacionární fáze Mobilní fáze  kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie) Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní Nejčastěji sloupcová chromatografie Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie

31 Instrumentace pro LPC Pumpa – peristaltická nebo gravitace
Gradient – mísič gradientu Dávkování – přímo pumpou na kolonu Kolony – skleněné Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm Vyhodnocování – zapisovač Sběrač frakcí – programovatelný

32 Částice sorbentu

33 Chromatografické metody pro separaci proteinů
Gelová chromatografie Ionexová chromatografie Chromatografie s hydrofóbní interakcí Afinitní chromatografie

34 Gelová chromatografie
Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu  nemísitelnost s mobilní fází Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později Isokratická eluce Objem vzorku < 2 % objemu kolony Chromatografické materiály  zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid Možnost stanovení molekulových hmotností Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

35 Gelová permeační chromatografie

36 Gelová permeační chromatografie
Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula

37 Ionexová chromatografie
Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! Celulosové a dextranové ionexy

38 Ionexy Katexy – záporný náboj  vazba kationtů
silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO3- slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO- Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

39 Ionexová chromatografie proteinů
Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

40 Ionexová chromatografie
Nanášení vzorku – nízká iontová síla Eluce – gradientová Zvyšováním iontové síly Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

41 Typická ionexová chromatografie
Loading ends, Low salt wash begins Salt gradient Protein absorbance II III Salt gradient ends Salt gradient begins Peak of unbound protein Loading starts I Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins

42 Chromatografie s hydrofobní interakcí
Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny  intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl) Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby) Interakci podporuje vysoká iontová síla

43 Hydrofobní chromatografie
Stacionární fáze – - C8, -fenyl Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH4)2SO4) Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

44 Afinitní chromatografie - princip
Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu  látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické) Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce Látka navázaná na nosič  afinitní ligand Vazba ligandu přes raménko (spacer)

45 Předpoklady pro vznik komplexu
Sterické – použití raménka (spacer) Optimální pH, iontová síla

46 Předpoklady pro vznik komplexu
Vazebné Konformační

47 Afinitní páry

48 Interakce mezi DNA a endonukleasou

49 Afinitní chromatografie
1. Analog substrátu Afinitní ligand Enzym + Nosič Raménko Enzym vázaný v aktivním místě 2. Imunoafinitní chromatografie Protilátka Proteinový epitop + Nosič Raménko Enzym vázaný na protilátku

50 Provedení Nanesení vzorku – nízká iontová síla
Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)

51 Chromatografie na imobilizovaných barvivech
Dye-binding chromatografie Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích Barviva částěčně podobná některým kofaktorům Isolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin)

52 Metal chelate chromatografie
Chelatující skupiny navázané na chromatografické nosiče  vazba iontů těžkých kovů (např. Ni2+) Interakce kovových iontů s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu Isolace rekombinantních proteinů s His6 částí

53 Chromatofokusace Použití ionexových chromatografických materiálů pro separaci podle isoelektrických bodů Kolona s vhodným ionexem je ekvilibrována v pufru o vysokém pH (vyšší než IEB cílové bílkoviny), vzorek je nanesen v témže pufru, poté je kolona promývána pufrem o nízkém pH obsahujícím amfolyty. Při průchodu pufru s amfolyty kolonou se vytváří pohybující se gradient pH. Proteiny se v koloně rozdělují podle hodnot isoelektrického bodu.

54 Magnetické separační techniky
Imobilizace afinitních ligandů nebo iontově výměnných skupin na magnetické nosiče Magnetické sorbenty připravené z biopolymerů vykazujících specifitu k cílovému proteinu Vsádková separace cílových proteinů Výhoda – možnost práce v obtížně manipulovatelných systémech (např. suspenze kultivační média, homogenáty buněk ...) Možnost isolace cenných biologicky aktivních látek ze sekundárních surovin (odpadů) BioMagn. Res. Technol. 2 (2004) 7

55 Základní zásady Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace  možné snížení výtěžku) Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu

56 Základní zásady (typické příklady)
Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou)  chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)

57 Nevhodné kombinace Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok  dialýza, ultrafiltrace)

58 Sledování průběhu separace
Metoda Celková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita Přečištění Výtěžek extrakt 100 1 - 100 % HIC 50 99 1.99 99 % IEX 25 75 3 3.0 75 %

59 Elektroforesa Proteiny se pohybují v nosiči (obvykle polyakrylamidový gel) vlivem elektrického pole Pohyb proteinu závisí na Náboji proteinu a jeho molekulové hmotnosti Intenzitě elektrického pole Typu a porozitě gelu Různé typy (PAGE, SDS-PAGE) Význam: kontrola čistoty separovaného proteinu

60 PAGE elektroforesa Polyakrylamid o různé velikosti pórů použit jako nosič Proteiny jsou rozpuštěny v zásaditém pufru V elektrickém poli se proteiny pohybují směrem k anodě

61 SDS elektroforesa SDS denaturuje všechny typy proteinů
Váže se na proteiny v konstantním poměru (1 molekula SDS na 2 aminokyselinové zbytky) všechny proteiny získají vysoký záporný náboj separace probíhá pouze podle velikosti molekulové hmotnosti

62 Sledování čistoty proteinů
Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou hmotnost isolovaného proteinu (SDS elektroforesou) Nenavázané proteiny Eluované proteiny Původní vzorek Standardy