Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Proč isolovat enzymy? •Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu •Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou •Odstranění.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Proč isolovat enzymy? •Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu •Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou •Odstranění."— Transkript prezentace:

1

2 Proč isolovat enzymy? •Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu •Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou •Odstranění nežádoucích doprovodných složek (např. proteasy  degradace cílových enzymů; enzymové inhibitory  snížení aktivity cílových enzymů) •V řadě aplikací je nutno používat vysoce přečištěné enzymové preparáty (např. medicina  urokinasa, streptokinasa...)

3 Zdroje enzymů •Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny •Selekce optimálních producentů (maximální produkce enzymu, optimální vlastnosti enzymu, snadné získání producenta, snadnost purifikačního postupu...) Selekce bakteriálních producentů amylas

4 Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru...) - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou)

5 Živočišné zdroje •Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci •Jateční zvířata – orgány, krev •Člověk – tělní tekutiny (krev  plasmin, thrombin...; moč  urokinasa...) •Bezobratlí (hmyz, plži, mlži  málo se využívají)

6 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek

7 Problémy se vzorkem •Komplexnost biologické matrice (velké množství doprovodných bílkovin a jiných látek) •Malá množství cílového enzymu •Labilita enzymu

8 Zásady pro práci s biologickým materiálem 1.Pokud možno zpracovat co nejdříve 2.V případě potřeby zmrazit (– 60 – 80 o C) 3.Rozmrazování – co nejrychleji 4.Nízká teplota při isolaci 5.Vhodné pH + iontová síla 6.Vhodná koncentrace bílkoviny 7.Zabránění pěnění 8.Omezení nežádoucí proteolytické aktivity 9.Přídavek specifických látek (např. merkaptoethanol, EDTA...)

9 Cíl izolace •Získání homogenní bílkoviny •Zachování biologické aktivity Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného (optimálního) úsilí

10 Distribuce enzymů •Intracelulární •V periplasmatickém prostoru •Extracelulární cytoplasma periplasma

11 Membránově vázané bílkoviny

12 Úprava biologického materiálu •Mletí (kulový mlýnek, masový strojek) •Homogenizace (rozmělnění biologického materiálu v pufru) - Elvehjem-Potterův homogenizátor - třecí miska s pískem - výkonný mixer

13 Dezintegrace mikrobiálních buněk •Narušení buněčné stěny •Způsoby – fyzikální - chemické - enzymové

14 Fyzikální způsoby dezintegrace •Třecí miska + balotina, písek... •Střídavé zmražování a roztávání •French press (protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) •X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) •Ultrazvuk •Mlýnek se skleněnými balotinami X-press

15 Chemické způsoby dezintegrace •Acetonová sušina (homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu) •Osmotická lyse  erytrocyty (suspenze v hypotonickém prostředí) •Přídavek tenzidů (poškození buněčné membrány) •Přídavek toluenu (toluen extrahuje při 35 – 40 o C fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu)

16 Enzymové způsoby dezintegrace •Lysozym (v kombinaci s osmotickým šokem)  rozrušení buněčné stěny bakterií (zejména G + ), následné zředění destilovanou vodou

17 Metody isolace enzymů •Srážení (precipitace) •Membránové separační procesy •Chromatografie •Elektroforéza

18 Srážení •Nezaměňovat s denaturací – bílkoviny zůstávají v nativním stavu •První metody používané pro separaci bílkovin – EtOH, (NH 4 ) 2 SO 4 •Filtrace nahrazena centrifugací

19 Vysolování vsolovánívysolování

20 (NH 4 ) 2 SO 4 •Rozpustnost se málo mění s teplotou •Saturovaný roztok 4 M - hustota 1,235g/cm 3 umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm 3 ) •Levný •Stabilizuje bílkoviny •Relativně čistý

21 Srážení - dvojstupňově

22 Provedení El. míchačka Chlazení Míchání 10-30’ Centrifugace pevný (NH 4 ) 2 SO 4 nebo saturovaný roztok (NH 4 ) 2 SO 4 úprava pH NH 4 OH

23 Srážení organickými rozpouštědly •Kompletně mísitelné s vodou •Nereagují s bílkovinou •Musí mít dobrý precipitační efekt •Srážení za nízké teploty (< 0 °C)!!! •Možné dvoustupňové srážení EtOH, aceton, MetOH, propanol, dioxan

24 Srážení organickými polymery a sloučeninami Princip identický jako srážení s rozpouštědly •DEAE dextran •PEG •Polyakrylová kyselina •Rivanol (2-ethoxy-6,9-diaminoakridinlaktát) •Kaprylová kyselina

25 Srážení selektivní denaturací •Při této metodě denaturujeme balastní bílkoviny, cílová bílkovina (enzym) musí zůstat z % v nativním stavu. •Denaturační vlivy – T, pH, org. rozpouštědla •Balastní bílkovina musí nejen denaturovat, ale i precipitovat

26 Tepelná denaturace •Přídavky některých látek (substráty, koenzymy, inhibitory) zvyšují stabilitu cílových bílkovin •pH při tepelné denaturaci musí být přesně definováno •Při vyšší teplotě může více probíhat proteolýza

27 Membránové separační metody •Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul •Membránová filrace (ultrafiltrace)  rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti; zakoncentrování proteinů, odstranění nízkomolekulárních látek (např. solí). Probíhá za vyššího tlaku •Dialýza  difuze nízkomolekulárních látek membránou; oddělením solí po vysolování bílkovin

28 Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

29 Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza

30 Chromatografické metody – základní rozdělení •Distribuce složek mezi dvěma fázemi  mobilní a stacionární fáze •Mobilní fáze  kapalina (kapalinová chromatografie); plyn (plynová chromatorafie) •Stacionární fáze  částečky tuhé fáze, tenká vrstva kapaliny na pevných částicích, kapalina v pórech chromatografického nosiče, film kapaliny na vnitřní straně kapiláry •Opakovaný transport složek do stacionární fáze a zpět do fáze mobilní •Nejčastěji sloupcová chromatografie •Nízkotlaká, střednětlaká (FPLC) a vysokotlaká (HPLC) chromatografie

31 Instrumentace pro LPC •Pumpa – peristaltická nebo gravitace •Gradient – mísič gradientu •Dávkování – přímo pumpou na kolonu •Kolony – skleněné •Detekce – spektrofotometrická 254, 280 nm •Vyhodnocování – zapisovač •Sběrač frakcí – programovatelný

32 Částice sorbentu

33 Chromatografické metody pro separaci proteinů •Gelová chromatografie •Ionexová chromatografie •Chromatografie s hydrofóbní interakcí •Afinitní chromatografie

34 Gelová chromatografie •Separace molekul podle velikosti (molekulové hmotnosti) a tvaru •Rozdělovací chromatografie v systému kapalina – kapalina •Stacionární fází je kapalina, zakotvená v gelu  nemísitelnost s mobilní fází •Velké molekuly se eluují dříve, malé molekuly se eluují později •Isokratická eluce •Objem vzorku < 2 % objemu kolony •Chromatografické materiály  zesítěný dextran (Sephadex), agarosa, polyakrylamid •Možnost stanovení molekulových hmotností •Odstraňování nízkomolekulárních sloučenin (odsolování)

35 Gelová permeační chromatografie

36 Pořadí eluce : největší>střední>nejmenší molekula

37 Ionexová chromatografie •Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj •Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje •V případě proteinů hraje zásadní roli pH ! •Celulosové a dextranové ionexy

38 Ionexy •Katexy – záporný náboj  vazba kationtů silné – sulfo (S), sulfopropyl(SP) OSO 3 - slabé – karboxy (C), karboxymethyl (CM) COO - •Anexy – kladný náboj  vazba aniontů slabé – diethylaminoethyl (DEAE) silné – triethylaminoethyl (TEAE)

39 Ionexová chromatografie proteinů •Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny •pH < pI  bílkovina nese kladný náboj  separace na katexu •pH > pI  bílkovina nese záporný náboj  separace na anexu •pH = pI  celkový náboj bílkoviny je nulový  nelze provést ionexovou chromatografii

40 Ionexová chromatografie •Nanášení vzorku – nízká iontová síla •Eluce – gradientová •Zvyšováním iontové síly •Změnou pH Použití – purifikace a zakoncentrování proteinu, výměna pufru

41 Typická ionexová chromatografie Loading starts Loading ends, Low salt wash begins Protein absorbance Peak of unbound protein Salt gradient 0 1M Salt gradient begins Salt gradient ends Eluted peaks of weakly bound (I), moderately bound (II) and tightly bound (III) proteins II III I

42 Chromatografie s hydrofobní interakcí •Proteiny mají na svém povrchu hydrofóbní skupiny  intreakce s chromatografickými nosiči, které nesou hydrofóbní skupiny (oktyl, fenyl) •Nebezpečí denaturace proteinu (v případě silné vazby) •Interakci podporuje vysoká iontová síla

43 Hydrofobní chromatografie •Stacionární fáze – - C 8, -fenyl •Mobilní fáze – vodné roztoky s vysokou koncentrací solí (např. 1.7 M (NH 4 ) 2 SO 4 ) •Eluce – snižováním iontové síly Použití : purifikace a zakoncentrování bílkovin, možno použít přímo po vysolování síranem amonným

44 Afinitní chromatografie - princip •Využití schopnosti biologicky aktivních látek specificky rozpoznat jinou molekulu  látky mají k sobě afinitu (jsou vzájemně biospecifické) •Typ adsorpční chromatografie využívající specifické interakce •Látka navázaná na nosič  afinitní ligand •Vazba ligandu přes raménko (spacer)

45 Předpoklady pro vznik komplexu •Sterické – použití raménka (spacer) •Optimální pH, iontová síla

46 Předpoklady pro vznik komplexu •Vazebné •Konformační

47 Afinitní páry

48 Interakce mezi DNA a endonukleasou

49 Afinitní chromatografie Nosič Raménko Afinitní ligand + Enzym vázaný v aktivním místě 1. Analog substrátu Nosič Raménko Protilátka + Enzym vázaný na protilátku 2. Imunoafinitní chromatografie Proteinový epitop Enzym

50 Provedení •Nanesení vzorku – nízká iontová síla •Eluce – selektivní - volným ligandem – neselektivní - změna pH, iontové síly, polarity Použítí : purifikace a zakoncentrování proteinů (i jednostupňová)

51 Chromatografie na imobilizovaných barvivech •Dye-binding chromatografie •Reaktivní barviva vázaná na chromatografických nosičích •Barviva částěčně podobná některým kofaktorům •Isolace enzymů i neenzymových bílkovin (např. albumin)

52 Metal chelate chromatografie •Chelatující skupiny navázané na chromatografické nosiče  vazba iontů těžkých kovů (např. Ni 2+ ) •Interakce kovových iontů s exponovanými histidylovými zbytky na povrchu molekuly proteinu •Isolace rekombinantních proteinů s His 6 částí

53 Chromatofokusace •Použití ionexových chromatografických materiálů pro separaci podle isoelektrických bodů •Kolona s vhodným ionexem je ekvilibrována v pufru o vysokém pH (vyšší než IEB cílové bílkoviny), vzorek je nanesen v témže pufru, poté je kolona promývána pufrem o nízkém pH obsahujícím amfolyty. Při průchodu pufru s amfolyty kolonou se vytváří pohybující se gradient pH. Proteiny se v koloně rozdělují podle hodnot isoelektrického bodu.

54 Magnetické separační techniky •Imobilizace afinitních ligandů nebo iontově výměnných skupin na magnetické nosiče •Magnetické sorbenty připravené z biopolymerů vykazujících specifitu k cílovému proteinu •Vsádková separace cílových proteinů •Výhoda – možnost práce v obtížně manipulovatelných systémech (např. suspenze  kultivační média, homogenáty buněk...) •Možnost isolace cenných biologicky aktivních látek ze sekundárních surovin (odpadů) BioMagn. Res. Technol. 2 (2004) 7

55 Základní zásady •Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu •Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce, množství cílového proteinu je menší •Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace  možné snížení výtěžku) •Jednotlivé separační metody pokud možno neopakovat •Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu

56 Základní zásady (typické příklady) •Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku)  chromatografie s hydrofóbní interakcí •Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou)  chromatografie s hydrofóbní interakcí •Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence (odstranění fragmentů a komplexů)

57 Nevhodné kombinace •Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok  dialýza, ultrafiltrace)

58 Sledování průběhu separace MetodaCelková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita PřečištěníVýtěžek extrakt % HIC % IEX %

59 Elektroforesa •Proteiny se pohybují v nosiči (obvykle polyakrylamidový gel) vlivem elektrického pole •Pohyb proteinu závisí na –Náboji proteinu a jeho molekulové hmotnosti –Intenzitě elektrického pole –Typu a porozitě gelu •Různé typy (PAGE, SDS-PAGE) •Význam: kontrola čistoty separovaného proteinu

60 PAGE elektroforesa •Polyakrylamid o různé velikosti pórů použit jako nosič •Proteiny jsou rozpuštěny v zásaditém pufru •V elektrickém poli se proteiny pohybují směrem k anodě

61 SDS elektroforesa •SDS denaturuje všechny typy proteinů •Váže se na proteiny v konstantním poměru (1 molekula SDS na 2 aminokyselinové zbytky)  všechny proteiny získají vysoký záporný náboj  separace probíhá pouze podle velikosti molekulové hmotnosti

62 Sledování čistoty proteinů •Elektroforéza dokumentuje průběh purifikačního procesu •Při použití standardů o známé molekulové hmotnosti je možno zhruba stanovit molekulovou hmotnost isolovaného proteinu (SDS elektroforesou) Standardy Původní vzorek Nenavázané proteiny Eluované proteiny


Stáhnout ppt "Proč isolovat enzymy? •Pro detailní studium je zapotření enzym získat v čistém stavu •Získáme preparát s definovanou specifickou aktivitou •Odstranění."

Podobné prezentace


Reklamy Google