Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

F.I.S.H.. Příprava sond pro komparativní genomovou hybridizaci z malého množství materiálu Romana Zaoralová školitel: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. pracoviště:

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "F.I.S.H.. Příprava sond pro komparativní genomovou hybridizaci z malého množství materiálu Romana Zaoralová školitel: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. pracoviště:"— Transkript prezentace:

1 F.I.S.H.

2 Příprava sond pro komparativní genomovou hybridizaci z malého množství materiálu Romana Zaoralová školitel: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. pracoviště: Integrovaná laboratoř molekulární cytogenetiky, PřF MU a PDM FN Brno

3 1.úvod - CGH 2.cíle 3.metody WGA značení sond Příprava sond pro CGH z malého množství materiálu 4.materiál 5.výsledky

4 CGH - komparativní genomová hybridizace, detekce kvantitativních změn genetického materiálu - citlivost: 5-10 Mb (metafáze) - vyžadovaná velikost sondy: nad 300 bp - nutné 2-3  g DNA ( buněk, 1 b.  6,6 pg)

5 Cíle práce Amplifikace pikogramových množství DNA Následné fluorescenční značení Komparativní genomová hybridizace

6 Whole genome amplification – amplifikace veškeré DNA ve vzorku Metody DOP-PCR LA-PCR Tagged-PCR PEP i-PEP SDA - GenomiPhi Alu-PCR IRS-PCR

7 DOP-PCR - degenerate oligonucleotide primed PCR, '-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3' - rozdělení cyklů: preamplifikační krok SDA - GenomiPhi - strand displacement amplification - izotermní amplifikace - polymeráza fága  29

8 Nick-translace - inkorporace značených nukleotidů do DNA - kombinace dvou enzymů: DNáza + DNA polymeráza s 5‘-3‘ exonukleázovou aktivitou - dochází ke štěpení DNA

9 Ulysis - ULS ® - universal linkage system - sloučenina Pt konjugovaná s fluorochromem, reagující s N 7 guaninu - rychlá metoda (značení 15 minut) - vhodná pro značení krátkých fragmentů DNA – neštěpí řetězec

10 Materiál Testování: normální DNA naředěná na definovanou koncentraci Aplikace: archivní materiál – onkologické vzorky: solidní nádory mikrodisekce

11 Výsledky – WGA SDA/GenomiPhi DOP-PCR, Taq polymeráza DOP-PCR, „long“ polymerázy

12 Výsledky – značení sond Značení přidáním nukleotidů do PCR Nick translace ULS Nick translace

13 Další postup „long“ polymerázy + nick translace: aplikace na známé vzorky, popis rozsahu citlivosti a použitelnosti v závislosti na typu aberací a počtu dostupných buněk Výhledově: HR-CGH, kvantitativní popis amplifikace

14 F.I.S.H.


Stáhnout ppt "F.I.S.H.. Příprava sond pro komparativní genomovou hybridizaci z malého množství materiálu Romana Zaoralová školitel: doc. RNDr. Petr Kuglík, CSc. pracoviště:"

Podobné prezentace


Reklamy Google