RxFISH.

Prezentace na téma: "RxFISH."— Transkript prezentace:

1 RxFISH

2 RxFISH =fluorescenční in situ hybridizace (rainbow = duha)
- 1997, skupinou kolem profesora Malcolma Fergusona Smitha jedna z nedávných pokroků ve FISH technologii mnohobarevná pruhovací chromozomová analýza sondy se vyrábějí z giboní chromozomální DNA; využívá se vysokého stupně homologie genomu

3 Mnohobarevné FISH techniky
M FISH - 1996, Speicher každý chromozom odlišen určitou barvou SKY FISH 1996, Schröcková 24 chromozomově specifických celochromozomových sond, které byly vytvořeny na základě kombinačního značení za použití 5 různých fluorochromů

4 Metodický postup Příprava kvalitního preparátu
Zestaršení preparátu – inkubace v 2x SSC a dehydratace ve vzestupné alkoholové řadě Permeabilizace – odstranění cytoplazmy, zlepšení průniku DNA sond (pepsin, alkoholová řada) Denaturace cílového místa – denaturace 70% formamidu + 2x SSC, dehydratace v ledové vzestupné etanolové řadě Příprava a denaturace sondy

5 Hybridizace DNA sondy na cílový preparát – uzavření rámováním a inkubace ve vlhké komůrce
Omytí nespecificky navázané sondy Barvení pozadí – DAPI Detekce fluorescenčním mikroskopem Vyhodnocení a zpracování signálu

6 Výhody Rx FISH detekce těžko postižitelných intrachromozomálních (mikrodelece, duplikace,inverze...) interchromozomálních translokací interpetace markerových chromozomů vzorky se špatnou morfologií možnost rozlišení mezi p a q ramenem

7 Þ používá se v kombinace s
Nevýhody Rx FISH schopnost rozlišit asi jen 100 pruhů na haploidní karyotyp (narozdíl od G-pruhování, které rozliší 400 až 550 pruhů) některé pruhy se překrývají, nelze rozlišit např. 8q od 21q; 6q od 13q,17q a X Þ používá se v kombinace s G-pruhováním

8 Kombinace Rx FISH a G-pruhování

9 Aplikace Rx FISH - vůbec první využití k popisu chromozomálních přesmyků v nádorech u T-prolymfocytární leukémie T-lymfocyty mají charakteristickou morfologii, velmi časté jsou abnormality karyotypu – obvykle komplexy s mnohonásobnými přesmyky inv(14)(q11,q32) t(14,14)(q11,q32) t(X,14)(q28,q11) i(8)(q10) t(8,8)(p21,q11)

10 Rx FISH metoda umožnila identifikovat nové aberace, které nebyly možné odhalit konvenčním barvením
kombinace Rx FISH a G-pruhování umožňuje přesnou karyotypizaci např. solidních tumorů, leukémií atd.