Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc Pavlína Kovářová Analýza a třídění.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc Pavlína Kovářová Analýza a třídění."— Transkript prezentace:

1 Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc Pavlína Kovářová Analýza a třídění chromozomů

2 Průtokový cytometr BD FACSVantage (2 lasery, 8 parametrů) Analýza:  Mikrospóry  Protoplasty  Buněčná jádra  Chromozómy  Chloroplasty

3 Schéma průtokového cytometru Laser Unášecí tekutina Regulátor tlaku Průtoková komora + - Sběrná zkumavka Vzorek Vychylovací destička Elektrický pulz Vychylovací destička

4 Princip třídění  Analýza optických parametrů: fluorescence a rozptyl  Společná analýza osmi parametrů  Rychlost třídění (10 2 – 10 4 chr./ sec)

5 Materiál používaný k přípravě suspenze chromozomů:  Buněčné kultury  Protoplasty listového mezofylu  Meristemy kořených špičky Příprava suspenze chromozomů Extrakce chromozomů Cytometrická analýza Příprava Buněčná synchronizace Akumulace v metafázi Barvení chromozomů Třídění chromozomů

6 Flow karyotyp Idiogram Relativní obsah DNA Frekvence Idiogram Flow karyotyp vyjadřuje závislost relativního obsahu DNA na počtu daného typu chromozomů Detekce strukturálních a početních změn chromozomů v karyotypu Teoretický flow karyotyp

7 Flow karyotyp Relativní intenzita fluorescence Relativvní frekvence Chinese Spring I II III I: 1D, 4D, 6D; II: 1A, 3A, 6A, 2D, 3D, 5D, 7D; III: 2A, 4A, 5A, 7A, 1B, 2B, 4B, 5B, 6B, 7B 3B Vrana et al. (2001) Hexaploidní pšenice (1C = Mbp) Identifikace a určení čistoty tříděné frakce : FISH PRINS PCR

8 Použití chromozomových linií :  Translokační linie  Deleční linie  Adiční linie Specifické chromozomové barvení  AT a GC nukletidových bazí Diskriminace jednotlivých chromozomů

9 Kromě chromozomu 3B je v histogramu oddělený pík pro translokační chromozomy 5BL·7BL a 4AL·4AS-5BL, které můžeme snadno třídit. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem. Třídění translokačních linií u pšenice „Cappelle Desprez“ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 3B3B I II III „Jubilar“ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence I II III 3B3B 4AL·4AS-5BL 5BL·7BL Kubalakova et al. (2002)

10 Jednotlivá ramena chromozomů můžeme třídit z ditelosomockych linií nebo z linií nesoucích izochromozomy. Chromozomy jsou identifikovány pomocí PRINS s GAA mikrosatelitem „Chinese Spring“ iso5BL Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 3B II III Třídění chromozomových ramen u pšenice I iso5BL „Chinese Spring“ Dt1BS Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 3B I II III 1BS Kubalakova et al. (2002)

11 Adiční linie pšenice a žita Jednotlivé chromozomy žita mohou být tříděny z adiční linie pšenice– žito. Tříděné žitné chromozomy jsou identifikovány FISH s pSc119.2 repeticí a GAA mikrosatelitem. T. aestivum (21'' + 1'' 6R) Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 6R 3B3B II III I Secale cereale „Selgo“ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 5BL·7BL 1R - 6R Kubalakova et al. (2003)

12 Secale cereale „Adams “ Relativní intenzita fluorescence Relativní frekvence 2R - 7R 1R1R B 119 Afa Translokace BS·BL-1RS 5S 45S Afa 45S DAPI Tato translokace byla detekována u 0.5% tříděných B chromozomů B Detekce vzácných strukturálních změn genomu Průtoková cytometrie umožňuje analýzu velkého množství chromozomů (<10 3 ) a tím detekci vzácných strukturálních změn.

13 “High-resolution” FISH na natažených chromozomech Valarik et al. (v tisku ) Tříděné chromozomy mohou být nataženy až na 100 x větší délku, než byla ta původní, čímž se výrazně zlepší prostorové rozlišení až o dva řády. PI BAC9 17 μm (1x) 1352 µm (79.5x) 42 µm Chromosome 3B (T. aestivum)

14 Gelová elektroforeza PCR Třídění III III IV Standartní karyotyp 1234 I II Translokace 56 Třídění 10 2 chromozomů trvá jen několik minut, proto je PCR velmi výhodným nástrojem k fyzickému mapování. Fyzické mapování pomocí PCR se specifických primerů

15 Konstrukce chromozomově specifických BAC knihoven Ligace do defosforylovaného BAC vektoru E. coli transformace Izolace vysokomolekulárni DNA Cytometrická analýza a třídění I II III 3B Chinese Spring 2 3S 1 kbp Kolonie Uspořádání na 384-jamkové destičky 3 BAC DNA knihovny byly konstruovány z tříděných chromozomů pšenice: 3B chromosomově-specifická BAC knihovna 1D, 4D, 6D subgenomicka BAC knihovna BAC knihovna specifická pro chromozomové rameno 1BS Šafář et al. (přijato do tisku); Janda et al. (v přípravě)

16 V BAC knihovně hledáme specifické klony, které mapujeme na mitotických chromozomech pomocí in situ hybridizace. Filtr po hybridizaci s genomickou DNA Málo repetitivní BAC Vysoce repetitivní BAC BAC DAPI Tříděné 3B chromozomy Fyzické mapování BAC klonů na tříděné chromozomy 63C1163B1363N281B7

17 Závěr  Průtoková cytometrie může být použita ke třídění mitotických chromozomů zemědělsky významných obilovin a leguminóz.  Flow karyotyping je vhodný ke kvantitavní detekci numerických a strukturálních změn chromozomů  Tříděné chromozómy jsou vhodné pro fyzické mapování použitím FISH, PRINS and PCR  Tříděné chromozomy lze využít ke konstrukci chromozomově specifických BAC knihoven

18 Naše laboratoř


Stáhnout ppt "Laboratoratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie Ústav experimentální botaniky Olomouc Pavlína Kovářová Analýza a třídění."

Podobné prezentace


Reklamy Google