Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací Barbora Branská Vysoká škola chemicko technologická v Praze Ústav kvasné chemie a bioinženýrství.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací Barbora Branská Vysoká škola chemicko technologická v Praze Ústav kvasné chemie a bioinženýrství."— Transkript prezentace:

1 Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací Barbora Branská Vysoká škola chemicko technologická v Praze Ústav kvasné chemie a bioinženýrství Ústav kvasné chemie a bioinženýrství

2 Mikroorganismy a průtoková cytometrie  Konstrukce cytometrů  Velikost – (detekce částic, intenzita odezvy, rel. fluorescenční odezva)  Tvar buněk  Minimum informací x rozmanitost mikroorganismů

3 Mikroorganismy  Saccharomyces cerevisiae  Pichia pastoris  produkční systém pro syntézu rekombinatních proteinů, indukovatelný silný promotor AOX  Thermus sp., T. ruber, T. aquaticus  biodegradační schopnosti, syntéza termostabilních enzymů

4 Hlavní body z biotechnologického pohledu  Růstová dynamika  Fyziologické změny  Morfologické znaky  Viabilita  Enzymová aktivita  Obsah intracelulárních složek

5 Morfologie  Cytometrie  Velikost - FSC, EV  Tvar - SSC  Mikroskopie + analýza obrazu  Velikost - plošný obsah  Tvar – šířka, délka, cirkularita,…

6 Morfologie cytometr x mikroskop

7 Fluorescenční značení - viabilita  Membránová integrita  Propidium jodid, ethidium bromid, Sytox green  Transmembránový potenciál  Rhodamin123, DiOC 2 (3), bis-oxonol  Enzymová aktivita  Fluorescein diacetát, karboxyfluorescein diacetát

8 Integrita buněčných membrán  Propidium jodid  náboj +2  neproniká do prokaryotních ani eukaryotních buněk s intaktní membránou  červená fluorescence, 20 x vyšší po vazbě na NK  Ethidium bromid  náboj +1  pomalu proniká buněčnými membránami  červená fluorescence, 20 x vyšší po vazbě na NK  Sytox green  z živých buněk plně vylučován  zelená fluorescence, 1000 x vyšší po vazbě na NK

9 Membránová integrita  Směs vitálních a fixovaných b. S. cerevisiae  PI  EB  Sytox

10 Transmembránový potenciál  Rhodamin 123  Kladný náboj  Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu  Zelená i červená fluorescence  DiOC 2 (3)  Kladný náboj  Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu – změna intenzity červené fluorescence  Zelená i červená fluorescence  Bis-oxonol  Záporný náboj  Akumulace v depolarizovaných buňkách  Vazba na nepolární kompartmenty

11 DiOC 2 (3), Rhodamin 123  Pichia - mix  Saccharomyces - mix  Thermus  vitální  fixované

12 BOX

13 Esterázová aktivita  Fluorescein diacetát  lipofilní, nenabitá a nefluorescentní sonda,  snadno prochází buněčnými membránami,  v buňkách je hydrolyzována nespecifickými esterázami na anion fluoresceinu  špatná retence v buňkách  Karboxyfluorescein diacetát  podobné vlastnosti jako FDA  větší molekula, hůř prochází neporušenými membránami  lepší zádrž produktu v buňce

14 FDA - viabilita Histogram pichia fda Saccharomyces

15 CFDA  Saccharomyces, Pichia  vitální vzorek - nízká fluorescence  fixované buňky - vysoká fluorescence  Thermus  vitální vzorek - jasná fluorescence  fixované buňky - téměř bez fluorescence

16 FDA – esterázová aktivita

17 DNA – buněčný cyklus, FITC FITC  interakce s neprotonovanými alifatickými amino-skupinami → s N-koncem polypeptidu a ε-aminoskupinou lysinu  Srovnání s biuretovým spektrofotometrickým stanovením

18 Statistické vyhodnocení - opakovatelnost PIFDACFDADiOC 2 (3)Rh 123BOX Saccharomyces SD0,40,48 1,893,061,36 RSD0,790,92 2,55,043,08 Pichia SD0,75 1,222,871,11 RSD2,59 1,914,53,28 Thermus SD1,522,720,522,742,592,65 RSD2,13,631,123,963,423,69

19 Děkuji za pozornost


Stáhnout ppt "Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací Barbora Branská Vysoká škola chemicko technologická v Praze Ústav kvasné chemie a bioinženýrství."

Podobné prezentace


Reklamy Google