Praktické cvičení č. 3 ZÁKLADY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ Klonování PCR produktu do vektoru PCR®2.1-TOPO® a transformace do E. coli AMOLc Úvod do molekulární.

Prezentace na téma: "Praktické cvičení č. 3 ZÁKLADY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ Klonování PCR produktu do vektoru PCR®2.1-TOPO® a transformace do E. coli AMOLc Úvod do molekulární."— Transkript prezentace:

1 Praktické cvičení č. 3 ZÁKLADY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ Klonování PCR produktu do vektoru PCR®2.1-TOPO® a transformace do E. coli AMOLc Úvod do molekulární biologie a genetiky - cvičení Jaro 2011 Biologický ústav Lékařská fakulta Masarykova univerzita Kamenice 5, Brno

2 Genové inženýrství vytváření rekombinantních molekul DNA představujících pozměněné nebo nové geny nebo nové kombinace genů a jejich zavádění do genomů organizmů s cílem pozměnit jejich vlastnosti; metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro založené na přípravě rekombinantních molekul DNA a jejich klonování Klonování DNA A) vytváření klonů DNA vložením segmentu DNA do klonovacího vektoru za vzniku rekombinantní molekuly DNA a její následné pomnožení v hostitelském organizmu B) vytváření klonů DNA pomnožením specifického segmentu DNA polymerázovou řetězovou reakcí Rekombinantní DNA DNA vzniklá spojením molekul DNA různého původu nebo jejich fragmentů in vitro

3 Klonování genů Příprava rekombinantní DNA
Vnesení rekombinantní DNA do hostitelské buňky Namnožení bakterií s požadovanou sekvencí DNA v selekčním prostředí Izolace požadované DNA

4 Restrikční štěpení Endonukláza - enzym katalyzující hydrolýzu fosfodiesterových vazeb uvnitř polynukleotidového řetězce za vzniku oligonukleotidových fragmentů Restrikční endonukláza - sekvenčně specifická endonukláza, která štěpí ds DNA ve specifických sekvencích vytvářením dvouřetězcových zlomů

5 Rekombinantní DNA

6 Příprava rekombinantní DNA
DNA ligáza - enzym katalyzující ligaci polynukleotidů, tj. vytvoření fosfodiesterové vazby mezi 5´-koncem a 3´-koncem polynukleotidových řetězců nebo jejich fragmentů

7 EcoR I ….. G A A T T C ….. ….. C T T A A G …..

8

9 Vektory Klonovací vektor - replikon použitý k zavedení cizorodé DNA do buňky Expresní vektor - klonovací vektor obsahující regulační sekvence umožňující expresi do něj vloženého cizorodého genu (cizorodé DNA) PLAZMID BAKTERIOFÁG KOSMID BAC - umělý bakteriální chromozom YAC - umělý kvasinkový chromozom

10 Přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky
plazmid fragment DNA + = TRANSDUKCE TRANSFORMACE kompetentní RECIPIENTNÍ buňka

11 2. Selekční marker (rezistence k antibiotiku)
MCS 1. Počátek replikace 2. Selekční marker (rezistence k antibiotiku) 3. MCS - mnohočetné klonovací místo (multiple cloning site, polylinker) - krátká sekvence DNA ve vektoru obsahující větší počet restrikčních míst, do nichž se vkládá cizorodá DNA

12 Komerčně dostupný vektor pCR®2.1-TOPO
a princip TOPO klonování (Invitrogen)

13 Klonují se PCR produkty mající A přesah amplifikované Taq polymerázou (nespecifická transferázová aktivita) Linearizovaný vektor má na 3´- koncích přesah T Topoizomeráza se váže na specifickou sekvenci DNA 5´-CCCTT-3´a štěpí za ní fospodiesterovou vazbu, OH-skupina na 5´- konci PCR produktu reaguje s topoizomerázou a reakce probíhá v opačném směru = PCR produkt se liguje do vektoru a topoizomeráza se uvolňuje

14 Screening bakteriálních kolonií obsahující požadovanou sekvenci DNA
fragment genu lacZa, který kóduje část enzymu -galaktozidázy, obsahuje vektor chromosom hostitelské bakterie obsahuje fragment  kombinací těchto fragmentů vzniká aktivní -galaktozidáza aktivitu tohoto enzymu lze detegovat přidáním derepresoru lac-promotoru (IPTG) do media dosáhneme exprese fragmentu genu lacZa z vektoru a + W a-KOMPLEMENTACE a + W W-část b-galaktozidázy a-část b-galaktozidázy + VZNIKÁ FUNKČNÍ b-GALAKTOZIDÁZA

15 X-gal Modrý produkt -galaktozidáza
V případě přítomnosti chromogenního substrátu (X-gal) v mediu, je tato bezbarvá látka aktivitou -galaktozidázy přeměněna na barevný produkt = pokud do vektoru NEBYL vnesen inzert, a-část spolu s W-částí vytváří funkční b-galaktozidázu, která přeměňuje X-gal na modrý produkt = KOLONIE JSOU MODRÉ = pokud vektor obsahuje inzert, a-část je nefunkční, a tudíž nevzniká aktivní b-galaktozidáza = KOLONIE JSOU BÍLÉ IPTG, X-gal, antibiotikum X-gal -galaktozidáza Modrý produkt Detekce modrých a bílých kolonií

16 Klonování PCR produktu
Voda pro mol. biologii Komerčně dostupný klonovací vektor pCR® 2.1-TOPO PCR produkt 2 µl 0,3 µl podle tabulky připravíme reakci a inkubujeme 5 minut při lab. teplotě poté inkubujeme 2 minuty na ledu následuje transformace vzniklého konstruktu (ligační směsi)

17 Příprava ploten pro transformaci
budeme mít k dispozici agarové plotny obsahující ampicilin (100 µg/ml) na povrch agarových ploten rozetřeme hokejkou 50 µl roztoku IPTG (6 mg/ml) a 50 µl roztoku X-gal (4 mg/ml) po 30 min jsou misky připraveny k vysetí transformačních směsí

18 Transformace vzniklého konstruktu do buněk E. coli
do zkumavky s ligační směsí umístěné na ledu přidáme 50 µl kompetentních buněk (= schopných přijmout cizorodou DNA) paralelní kontrolní zkumavka bude obsahovat 50 µl kompetentních buněk a 1 µl cirkulárního plazmidu pCR® 2.1-TOPO obě zkumavky inkubujeme 20 minut na ledu a poté je podrobíme teplotnímu šoku ve vodní lázni  42 °C po dobu 60 sekund znovu inkubujeme na ledu po dobu 10 minut a vysejeme na agarové plotny s ampicilinem, IPTG a X-gal agarové plotny umístíme do termostatu při 37 °C, druhý den pozorujeme kolonie

19 Kontakt na učitele: Marie Zobaníková mzobanik@med.muni.cz
Praktické cvičení č. 3 ZÁKLADY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ Klonování PCR produktu do vektoru PCR®2.1-TOPO® a transformace do E. coli AMOLc Úvod do molekulární biologie a genetiky - cvičení Jaro 2011 Kontakt na učitele: Marie Zobaníková