Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

GENETICKÁ TRANSFORMACE BAKTERIÍ 1. Aequorea victoria copyright Claudia.E. Mills 1999 2.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "GENETICKÁ TRANSFORMACE BAKTERIÍ 1. Aequorea victoria copyright Claudia.E. Mills 1999 2."— Transkript prezentace:

1 GENETICKÁ TRANSFORMACE BAKTERIÍ 1

2 Aequorea victoria copyright Claudia.E. Mills

3 pGLO transformační souprava Genetická transformace Genová regulace Genová selekce DNARNAProtein Znak 3

4 Co je genetická transformace? Příjem cizorodé DNA (často molekula plazmidu) Bakteriální chromozóm Buněčná stěna Plazmid 4

5 Co je plazmid? cirkulární molekula DNA schopná se samostatně replikovat výskyt převážně u bakterií nejjednodušší bakteriální vektor (= molekula DNA používaná k inzerci cizorodé DNA do hostitelské buňky) uděluje bakterii nový znak (př. rezistence k ATB) 5

6 Inzerce cizorodé DNA do plazmidu plazmid gen pro GFP restrikční štěpení DNA přesahující konce DNA ligáza rekombinant plazmid 6

7 Plazmid pGLO – Beta Laktamáza Ampicillinová rezistence – AraC regulátor Reguluje transkripci GFP – Zelený fluorescenční protein GFP Aequorea victoria pGLO ori bla GFP araC 7

8 Ampicillin a rezistence Různá antibiotika účinkují na bakterie různě: nejčastěji blokují syntézu buněčné stěny nebo proteosyntézu. Ampicillin inhibuje syntézu peptidoglykanu (polymer buněčné stěny bakterií). β-lactamáza rozkládá laktamový kruh v molekula ampicillinu, a tím ho inaktivuje. 8

9 Genová regulace: bakteriální operony Laktózový (Lac) operon 9

10 Arabinózový operon Více o arabinózovém operonu na: s/Ara_operon.html DNA vazebný protein: blokuje transkripci Geny důležité pro metabolizmus arabinózy 10

11 Ara-GFP operon  Geny arabinózového operonu byly nahrazeny genem pro GFP  K transkripci genu pro GFP dochází pouze v přítomnosti arabinózy  11

12 Kdy může GFP ZÁŘIT? pokud je vystaven UV světlu energii vyzáří v podobě zeleného fluorescenčního světla 3-D struktura GFP Více o GFP na: 12

13 Jak to funguje v buňce? Bakterie transformované plazmidem pGLO 13

14 Metody transformace Molekuly DNA jsou příliš velké na to, aby byly prostou difúzí nebo transportem přeneseny skrz buněčnou membránu Elektroporace – Elektrický šok zvýší permeabilitu buněčných membrán pro DNA Teplotní šok – Chemicky-kompetentní buňky přijmou DNA po teplotním šoku 14

15 Proces transformace: souhrn Resuspendovat bakteriální kolonii v Transformačním roztoku Přidat plazmid pGLO Zkumavku umístit na led Teplotní šok 42 o C, umístit zkumavku na led Inkubace se živným médiem LB Vysetí na agarové plotny 15

16 Transformace krok po kroku  CaCl 2 transformační roztok poskytuje ionty Ca ++, které neutralizují negativní náboj DNA a fosfolipidů buněčných membrán a umožňují DNA vstoupit do buňky. 16

17  Teplotní šok zvýší permeabilitu buněčné membrány  Inkubace v živném médium LB umožní expresi beta laktamázy Transformace krok po kroku 17

18 Selekce Růst transformovaných bakterií a kontrolních bakterií za různých podmínek. Na jakých plotnách budou růst transformované buňky? Jaké kolonie budou fluorescenčně zářit? 18

19 Techniky sterilizace Bakterie a jiné mikroorganizmy jsou všudypřítomné! Sterilní prací předejdete možnosti kontaminace vzorku! Dodržujte bezpečnost práce!  Sterilizace vlhkým vzduchem – autokláv (při teplotě 121°C, čas cca 30 min)  Sterilizace suchým vzduchem – v plameni o 160°C a výše, méně účinné  Sterilizace UV zářením  Sterilizace filtrací (velikost pórů 0,1-0,2 mikrometry) 19

20 Měření objemů 20

21 Děkuji za pozornost 21


Stáhnout ppt "GENETICKÁ TRANSFORMACE BAKTERIÍ 1. Aequorea victoria copyright Claudia.E. Mills 1999 2."

Podobné prezentace


Reklamy Google