PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C1.

Prezentace na téma: "PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C1."— Transkript prezentace:

1 PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C1

2 PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C2 Obecná část: Specifická část: Doplňková část: GenomikaDNAKlonování DNA Transgenní rostliny GMO v zemědělství Slovník GMO: historie a zákony Opakování

3 PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C3  Podstata klonování  Základní kroky klonování  Praktické využití

4 Klonování = tvorba zcela identických kopií = klony V případě DNA: Množení úseku DNA určité buňky s využitím enzymů cizích buněk PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C4

5 1. Vnesení (inzerce) cizorodé DNA do klonovacího vektoru 2. Přenos vektoru do hostitelských buněk E. colli, transformace 3. Zmnožení (amplifikace) vektoru v buňkách hostitele, kultivace 4. Výběr (selekce) buněk obsahujících rekombinantní plazmid PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C5

6 1. Vnesení (inzerce) cizorodé DNA do klonovacího vektoru  Klonovací vektor = nejčastěji bakteriální plazmid  Pomocí restrikčních enzymů se plazmid naruší (otevře)  Mísení s fragmenty DNA, které je potřeba začlenit do plazmidu  Začlenění fragmentu DNA do plazmidu pomocí spojovacích enzymů (ligáz) PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C6

7 1. Vnesení (inzerce) cizorodé DNA do klonovacího vektoru PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C7 Bakteriální plazmid DNA Gen Izolace plazmidu Narušení plazmidu Vnesení žádaného genu

8 2. Přenos vektoru do hostitelských buněk = transformace PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C8 Přímý vstup rekombinantní DNA do bakteriální buňky Je potřeba destabilizovat cytoplazmatickou membránu (např. mírným tepelným šokem)

9 3. Zmnožení (amplifikace) vektoru v buňkách hostitele PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C9 Naočkování bakterií na živné médium Kultivace a vznik kolonií

10 4. Výběr (selekce) buněk obsahujících rekombinantní plazmid  Každá kolonie vyroste z jedné buňky  Kultivaci je třeba provádět s ohledem na zvýhodnění bakterií z plazmidem – např. přítomnost antibiotika  K odlišení rekombinantních plazmidů se používají speciální geny, Např. modro/bílá selekce v závislosti na schopnosti hydrolyzovat sacharid PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce 2012 C10

11 PřF UP Bc. Milan Glabazňa, diplomová práce C11 http://www.med.muni.cz/patfyz/tmbg/Klonov%E1n%ED_MM.pdf