Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD. Molekulární biologie  * 50. léta 20. století  popis struktury DNA (J. D. Watson, F. Crick)  stavba a vztah.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD. Molekulární biologie  * 50. léta 20. století  popis struktury DNA (J. D. Watson, F. Crick)  stavba a vztah."— Transkript prezentace:

1 Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD

2 Molekulární biologie  * 50. léta 20. století  popis struktury DNA (J. D. Watson, F. Crick)  stavba a vztah biomolekul k funkcím a vlastnostem organizmů a vlastnostem organizmů

3 Genetické markery  genetické markery = značky, ukazatele se silnou genetickou kontrolou, neovlivněnou prostředím morfologické markery (barva květu)morfologické markery (barva květu) biochemické markery (přítomnost určitých látek v rostlině podmiňují geny -> přítomnost látky dokazuje přítomnost genu)biochemické markery (přítomnost určitých látek v rostlině podmiňují geny -> přítomnost látky dokazuje přítomnost genu) molekulární markery (analýzy DNA )molekulární markery (analýzy DNA )  DNA markery

4 Molekulární markery  umožňují identifikaci organizmu  stanoví příbuzenské vztahy  Výhoda DNA markerů: rychlá a spolehlivá determinace

5 RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism ( polymorfizmus v délce restrikčních fragmentů)  základní princip metody I.štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz II.elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky III.přenos fragmentů na membránu IV.hybridizace DNA

6 Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz  restrikční endonukleázy - enzymy izolované z bakterií –jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován (např.: EcoRI - Escherischia coli, AluI - Arthrobacter luteus) –rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí –tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu –sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp EcoRI - EcoRI - AluI -

7 Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky  elektroforéza obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly, resp. fragmenty DNA, podle jejich délky  princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru  stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoří proužek

8 Přenos fragmentů na membránu  fragmenty DNA je nutné před přenosem (nebo během přenosu) na membránu denaturovat  denaturací se rozumí rozpletení dvouřetězce DNA ve dva jednořetězce DNA  na gel je přiložena nylonová membrána na níž je specifickým způsobem otisknuta DNA

9 Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)  renaturace - proces vzniku dvouřetězcové DNA z jednořetězcových vláken  hybridizace – renaturace s dvojím původem jednořetězcové DNA  membrána s navázanou DNA se ponoří do roztoku jednořetězcové DNA, která je radioaktivně značena, tzv. sonda  sonda je krátká ( bází) a homologická (alespoň z větší části), aby k hybridizaci vůbec došlo  sonda se navazuje jen na místa s komplementárním řetězcem  po umytí a usušení je membrána přiložena na rentgenový film a ponechá se exponovat, film zčerná v místech, kde je navázána sonda

10 Pattern  elektroforetický profil (pattern)

11 Interpretace RFLP  porovnávání restrikčních fragmentů vzniklých štěpením odpovídajících úseků DNA patternpattern restrikční mapa - náročná záležitostrestrikční mapa - náročná záležitost  studium na úrovni rodů, druhů částečně poddruhů, nevhodnost při studiu mezi blízce příbuznými populacemi, nebo dokonce v rámci populace

12 Zhodnocení metody RFLP KLADY vysoká reprodukovatelnost patternvysoká reprodukovatelnost pattern vysoká interpretovatelnostvysoká interpretovatelnostZÁPORY nákladynáklady bezpečnost práce (radioaktivní materiál)bezpečnost práce (radioaktivní materiál) velké množství DNAvelké množství DNA množství sondymnožství sondy vysoce kvalifikovaný personálvysoce kvalifikovaný personál

13 PCR Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce) - vyvinuto v 80. letech 20. století - jedna z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické diagnostiky základní princip metody in vitro synéza vybraného úseku DNA, která probíhá v mnoha opakujících se cyklechin vitro synéza vybraného úseku DNA, která probíhá v mnoha opakujících se cyklech fragmenty nasyntetizované během reakce lze pozorovat na agarózovém gelufragmenty nasyntetizované během reakce lze pozorovat na agarózovém gelu možno analyzovat i velmi malé množství DNAmožno analyzovat i velmi malé množství DNA

14 PCR - teplotní fáze 1. teplotní fáze 95 °C - denaturace zvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí) 2. teplotní fáze °C – annealing ochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření krátkých dvoušroubovic DNA 3. teplotní fáze 72 °C – polymerace upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNA polymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5´  3´) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

15 Průběh PCR  daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí (2 n = počet fragmentů po n cyklech)  v praxi se používá cca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání reakčních složek a růst se zastavuje poznámka: billion je v češtině miliarda

16 Zhodnocení metody PCR KLADY levnější a technologicky snazší oproti RFLP levnější a technologicky snazší oproti RFLP malé množství zpracovávané DNA malé množství zpracovávané DNAZÁPORY vysoká čistota práce (případná kontaminace vzorku cizí DNA se fatálně projeví) vysoká čistota práce (případná kontaminace vzorku cizí DNA se fatálně projeví) nutnost znalosti sekvencí v bezprostředním sousedství úseku DNA, který chceme pomnožit (syntéza primerů) nutnost znalosti sekvencí v bezprostředním sousedství úseku DNA, který chceme pomnožit (syntéza primerů)

17 RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA ► jedná se o modifikaci PCR ► Nevyžaduje znalost cílové sekvence DNA ► Významná pro systematickou a populační biologii

18 Některá specifika metody RAPD oproti klasické metodě PCR ► R v názvu, zkracuje random, znamenající náhodný, protože výběr úseku, který bude pomnožen je ponechán náhodě ► v reakční směsi je přítomen pouze jeden primer o délce deseti nukleotidů ► reakční podmínky jsou odlišné (teplota 2. teplotní fáze je nižší (ca 34 °C), počet cyklů je vyšší ( cyklů))

19 Zhodnocení metody RAPD KLADY použitelnost pro jakýkoliv (neznámý) genompoužitelnost pro jakýkoliv (neznámý) genom technologicky jednoduchá a rychlá metodatechnologicky jednoduchá a rychlá metoda výsledky lze dobře kvantifikovat (sestavení matice a statistické zpracování)výsledky lze dobře kvantifikovat (sestavení matice a statistické zpracování)ZÁPORY nízká specifita reakce, nereprodukovatelnost výsledků mezi laboratořemi (lze srovnávat jen interpretace)nízká specifita reakce, nereprodukovatelnost výsledků mezi laboratořemi (lze srovnávat jen interpretace) lze hodnotit maximálně dva blízce příbuzné druhy (použití především v populační biologii)lze hodnotit maximálně dva blízce příbuzné druhy (použití především v populační biologii)

20 Molekulární markery v lesnictví Identifikace cizorodého organismu (parazita, mykorrhizy apod.) Identifikace cizorodého organismu (parazita, mykorrhizy apod.) Příbuzenské vztahy a původ Příbuzenské vztahy a původ Deklarace vlastností sadebního materiálu Deklarace vlastností sadebního materiálu Markery spojené s biotickými nebo abiotickými stresy Markery spojené s biotickými nebo abiotickými stresy

21 Nejvýznamnější zdroje informací

22 Děkujeme za pozornost.


Stáhnout ppt "Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD. Molekulární biologie  * 50. léta 20. století  popis struktury DNA (J. D. Watson, F. Crick)  stavba a vztah."

Podobné prezentace


Reklamy Google