Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Metody molekulární biologie MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D. Brno 2003 Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Metody molekulární biologie MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D. Brno 2003 Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno."— Transkript prezentace:

1 Metody molekulární biologie MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D. Brno 2003 Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno

2 Genomika – studium genomu 1. Strukturální - identifikace genů - umístění genu na chromozomu (fyzické mapování) - stanovení nukleotidové sekvence genu 2. Komparativní - mezidruhové srovnávání, evoluční studie 3. Funkční (RNA genomika) - genová exprese (jak geny fungují) 4. Farmakogenomika - využití genetiky při vývoji vakcín Proteomika – studium proteinů

3 Teorie objev nových genů a proteinů zkoumání mechanismu regulace eukaryontních genů studium funkce proteinů poznání evoluční historie eukar. genu (fylogenetické mapy) Praxe diagnostika původců infekčních onemocnění diagnostika genetických chorob (mutace v DNA), léčba farmaceutický průmysl – léky (př. inzulín pro diabetiky) potravinářství (identifikace přídavků do potravin) genové inženýrství (geneticky modifikované organismy) soudní lékařství - kriminalistika (identifikace osob) - testování paternity a maternity testování identity jedinců vzácných zvířat ověřování rodokmenů zvířat Využití metod molekulární biologie

4 Metody molekulární biologie Izolace DNA Materiál tělní tekutiny (krev, plodová voda, sliny) tkáně (vlasy, orgány) organismy (bakterie, viry, kvasinky, paraziti, rostliny, hmyz) čerstvý/zmrazený/parafinovaný materiál Postup komerční kity (enzym - proteáza, pufry, kolonky), izolace 20 min fenol chloroformová extrakce

5 1. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Fáze PCR denaturace DNA annealing – nasednutí primerů na komplementární úsek DNA extension – napojování nukleotidů Do reakce se dává testovaná DNA synteticky připravené primery (krátké úseky DNA) nukleotidy ve formě trifosfátů (ATP, TTP, CTP, GTP) enzym Taq polymeráza (z bakterie Thermus aquaticus) pufr obsahující Mg 2+ ionty Metody molekulární biologie - klonování Vytvoření (amplifikace) identických kopií určitého úseku DNA v přístroji „termocycler“ (K.Mullis, 1983)

6 Polymerázová řetězová reakce (PCR) 1 cyklus PCR Při 30 cyklech - amplifikace více než 10 9 kopií úseku DNA denaturace annealing extension 94 – 95 o C o C 72 o C

7 Typy PCR Jednoduchá PCR Nested, semi-nested PCR Koamplifikační, multiplexová (comultiplex, multiplex PCR) Reversní transkripční PCR (RT-PCR) Semikvantitativní, kvantitativní PCR - Komparativní (Q-PCR) - Kompetitivní (QC-PCR) - PCR v reálném čase (Real-time Q-PCR) Polymerázová řetězová reakce (PCR)

8 Metody molekulární biologie - klonování 2. Namnožení úseku DNA v bakteriích Postup - rozštěpení vektoru restrikční endonukleázou - začlenění fragmentu DNA do vektoru DNA-ligázou (enzym) - začlenění plazmidu s fragmentem DNA do bakterie - po namnožení bakterie, lýza bakterii a uvolnění plazmidů - vyštěpení fragmentu DNA z plazmidů restrikční endonukleázou Plazmidový klonovací vektor - malá kruhová molekula DNA (plazmid bakterie E.coli) - musí obsahovat replikační počátek - musí mít místo pro restrikční endonukleázu - musí mít gen pro rozlišitelnou vlastnost (rezistence k antibiotikům)

9 Genomová knihovna (chromozomální DNA) Lidská DNAFragmenty genomové DNA Rekombinantní DNA Genomová knihovna Rozštěpení DNA restrikční endonukleázou Inzerce DNA-fragmentů do plasmidů Vnesení plasmidů do bakterií

10 cDNA knihovna (komplementární DNA) - lýza buněk tkáně a izolace mRNA - pomoci enzymu reverzní transkriptáza přepis do sekvence DNA (cDNA= complementary, komplementární DNA) - naklonování molekul cDNA do plazmidových vektorů Výhoda: geny v této knihovně jsou bez intronů !!!

11 Metody molekulární biologie Gelová elektroforéza Postup příprava gelu – agarózový, polyakrylamidový gel obarvení vzorku – ethidium bromid, bromfenolova modř nanesení vzorku na gel - nastavení napětí a doby elektroforézy zviditelnění fragmentů DNA - UV transluminátor Princip Oddělení fragmentů DNA podle velikosti

12 Příklad výsledku gelové elektroforézy 1-7: pozitivní výsledek - amniové tekutiny gravidních žen (362 bp sekvence) 8: negativní kontrola 9: pozitivní kontrola (362 bp sekvence T. gondii) 10: 50 bp velikostní standart (ladder)

13 Metody molekulární biologie PCR/RFLP restriction fragment length polymorphism Fáze amplifikace specifického úseku DNA pomoci PCR štěpení enzymem „restrikční endonukleáza“ při 37 o C 1h analýza štěpných fragmetů DNA na agarózovém gelu HaeIII 5´ 3´ místo štěpení

14 RFLP Restrikční mapy - fyzická mapa štěpných míst v DNA - studium polymorfismu mezi druhy, v rámci druhu mezi kmeny, skupinami (fingerprinting) - př. alfa-globinový gen (studium příbuznosti Ho a ostatních primátů) Přehodnocování systematického zařazení jednotlivých organismů

15 Metody molekulární biologie Southern blotting Princip: přenos DNA (jednořetězcové) z gelu na nylonovou nebo nitrocelulózovou membránu na přístroji „vacuum blotter“ Postup: štěpení DNA restrikční endonukleázou elektroforéza depurinace DNA v HCl, denaturace DNA v NaOH Southern blotting (blotování) - pod vakuem 90 min. (3 vrstvy filtračního papíru, nylonová membrána, gumový rám, gel s DNA) - kapilární

16 Metody molekulární biologie Hybridizace Princip: Hybridizace = renaturace (proces obnovení vodíkových můstků mezi komplementárními bázemi), pomoci DNA sond se vyhledávají specifické nukleotidové sekvence. DNA sonda: krátká jednořetězcová DNA ( nukleotidů), značena - radioaktivně (izotop 32 P) - neradioaktivně (chemiluminiscence) Postup: uzavření membrány do plastikového sáčku spolu se značenou sondou hybridizace (navázání sondy na komplementární úseky DNA) vymytí membrány (odstranění nenavázané sondy) detekce - autoradigrafie - detekční látky (hydrogen peroxid a luminol) – fotograf.film

17 Metody molekulární biologie Elektroforéza, Southern blotting a hybridizace ElektroforézaSouhthern blotting Hybridizace sonda nitrocelul. papír s DNA autoradiograf neznačená rozštěpená DNA agarózový gel alkalický roztok nitrocel. papír mycí houba

18 Metody molekulární biologie Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování) Enzymová metoda Použití přístroje „sekvenátor“ Kompletní genom (údaje ke konci roku 2003) Eukaryota: 20 (Avena sativa, Glycine max, Hordeum vulgare, Lycopersicon esculentum, Oryza sativa, Triticum aestivum, Zea mays, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Danio rerio, Anopheles gambiae, Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Encephalitozoon cuniculi, Guillardia theta, Sacharomyces cerevisiae, Plasmodium falciparum, Schizosacharomyces pombe) Prokaryota: 17 (archebakterie), 128 (bakterie) Viry: 1656 Genová banka NCBI:

19 Metody molekulární biologie Stanovení nukleotidové sekvence DNA (sekvenování)

20 Genové inženýrství Využití: 1.Výroba buněčných proteinů ve velkém množství (insulin, růstový hormon, plášťové proteiny virů pro očkování….) 2.Syntéza velkého množství RNA (studium proteosyntézy) 3.Genová terapie 4.Výzkum nových genů Transgenní organismy – ve svém genomu obsahují nové geny, nebo geny pozměněné metodami rekombinantní DNA Klonování zvířat – 1996 (ovce), 1998 (skot, myš, koza), 2000 (prase, muflon), 2001 (kočka, divoký tur gaur), 2002 (králík), 2003 (mula, divoký tur banteng) (zdroj časopis 21. století/ 8. číslo,


Stáhnout ppt "Metody molekulární biologie MVDr. Eva BÁRTOVÁ, Ph.D. Brno 2003 Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno."

Podobné prezentace


Reklamy Google