Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ II Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ II Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek."— Transkript prezentace:

1 SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ II Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

2 s SDS-PAGE (= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) - metoda pro separaci proteinů dle velikosti (molekulové hmotnosti)

3 Pracovní postup  příprava polyakrylamidových gelů  smíchání lyzátů z tkání se vzorkovým pufrem  povaření vzorků při 95  C po dobu 4 min.  nanesení vzorků na gel  vlastní elektroforéza při konstantním napětí  barvení proteinů v gelu pomocí Coomassie Blue  odbarvení gelu  nalezení aktinu a myosinu ve vzorcích tkání, porovnání exprese proteinů mezi jednotlivými tkáněmi  chemiluminiscenční detekce aktinu

4 Myosin (těžký řetězec) --- Aktin --- Tropomyosin --- Myosin (lehký řetězec) 1. Marker 5. Aktin 2. Játra 6. Myosin 3. Srdce 7. Marker 4. Sval Separace proteinů v polyakrylamidovém gelu

5 Složení vzorkového pufru pro SDS-PAGE  Tris pufr utváří vhodné pH  SDS (dodecyl sulfát sodný) je detergent poskytující proteinům negativní náboj  glycerol díky vyšší hustotě zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení  bromofenolová modř je barvivo umožňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)

6 Úrovně organizace proteinů Primární struktura = pořadí aminokyselin v polypeptidovém řetězci Sekundární struktura = prostorové uspořádání hlavního řetězce části proteinu, např. α-helix a β-list Terciární struktura = trojrozměrné uspořádání celého peptidového řetězce, udržované disulfidickými vazbami, elektrostatickými a hydrofóbními interakcemi Kvartérní struktura = uspořádání podjednotek v proteinu

7  proteiny je nutné před separací denaturovat  obvykle působením SDS a tepla (zahřátí na cca 95°C)  zachována je tak POUZE primární struktura proteinů Příprava vzorku pro SDS-PAGE

8  denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj na jednotku délky proteinu daný vazbou SDS  rychlost migrace v gelu tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti Příprava vzorku pro SDS-PAGE

9 Negativně nabité proteiny se pohybují ke kladné elektrodě (anoda) Menší proteiny se pohybují rychleji Proteiny se rozdělují podle velikosti (molekulové hmotnosti) Jak funguje SDS-PAGE? + _

10 Proč používat k separaci proteinů polyakrylamidový gel?  polyakrylamidový gel: pevná a inertní matrix  ideální pro separaci proteinů  menší velikost pórů než u agarosy  proteiny jsou výrazně menší než chromozómy a běžně separované fragmenty DNA  vytvořen polymerací akrylamidu a N´,N´- methylenbisakrylamidu zahájenou volnými radikály vzniklými při rozkladu persíranu amonného (ammonium persulfate = APS).

11 měřena v daltonech (Da) či kilodaltonech (kDa), 1 kDa = 1000 Da Dalton = jednotka atomové hmotnosti = 1 Da se přibližně rovná hmotnosti atomu vodíku (1,66 x g) průměrný nukleotidový pár = 649 Da průměrná aminokyselina = 110 Da Molekulová hmotnost (velikost) proteinů 200 AA protein – cca 20 kDa vs. 100 bp fragment DNA – cca 65 kDa

12 ProteinkDaFunction titin3000center myosin in sarcomere dystrophin400anchoring to plasma membrane filamin270cross-link filaments into gel myosin heavy chain 210slide filaments spectrin 265attach filaments to plasma membrane nebulin107regulate actin assembly  -actinin100bundle filaments gelosin90fragment filaments fimbrin68bundle filaments actin42form filaments tropomyosin35strengthen filaments myosin light chain 27slide filaments troponin (T, I, C)30, 19, 17 mediate regulation of contraction thymosin5sequester actin monomers Hlavní proteinové složení svalů

13 Myosin (těžký řetězec) --- Aktin --- Tropomyosin --- Myosin (lehký řetězec) 1. Marker 5. Aktin 2. Játra 6. Myosin 3. Srdce 7. Marker 4. Sval Separace proteinů v polyakrylamidovém gelu

14 Western blot analýza (imunochemická detekce proteinů)  přenos proteinů separovaných pomocí SDS-PAGE z gelu na membránu  identifikace proteinu pomocí imunodetekce, tj. pomocí vazby primární a sekundární protilátky  vizualizace pomocí barevné reakce nebo chemiluminiscence  název vznikl jako slovní hříčka dle metody SOUTHERN blot (technika detekce DNA) zavedené Edwardem Southernem  analogicky byl vytvořen také název pro metodu NORTHERN blot (technika detekce RNA)

15 Chemiluminiscenční detekce aktinu aktin+myosin srdce sval játra srdce MW 30 ug proteinu stejný objem vzorku z různých izolací

16 Western blot – příklady klinických aplikací  detekce protilátek (např. potvrzení diagnózy) infekční borelióza, EBV, HIV, HSV, Helicobacter pylori autoprotilátky: antinukleární protilátky (ANA), protilátky proti neuronálním antigenům, profil autoimunitních chorob jater

17 Klinické aplikace - princip detekce Na proužky membrány byly po elektroforéze metodou WB „nablotované“ příslušné antigeny. Pozice proteinu (antigenu) odpovídá jeho molekulární hmotnosti. Jestliže je vzorek séra pacienta pozitivní, naváží se specifické protilátky ze séra na odpovídající antigen na membráně. Navázané protilátky reagují s anti-humánními protilátkami značenými alkalickou fosfatázou (AP).

18 Navázané protilátky jsou následně inkubovány s roztokem obsahujícím chromogenní substrát, což umožní barevnou reakci. V případě, že vzorek séra obsahuje specifické protilátky, objeví se v pozici odpovídající příslušnému antigenu tmavý proužek. Vyhodnocení proužků (přítomnost/nepřítomnost) na membráně nám určí zda je vzorek pozitivní/negativní (pacient nemocný/zdravý). Klinické aplikace - princip detekce

19 EUROLINE-WB: detection of antibodies against Borrelia EUROLINE ANA-Profile 3 Line immunoassay for confirmation and discrimination of antibodies HIV-1 and HIV-2

20


Stáhnout ppt "SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ II Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek."

Podobné prezentace


Reklamy Google