Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Sekvenování. Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Sekvenování. Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty."— Transkript prezentace:

1 Sekvenování

2 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

3 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

4 Znaková dat sekvence čtyř nukleotidů v RNA či DNA sekvence 20 aminokyselin v proteinu možnost převodu DNA na protein možnost převodu znakových dat na data distanční

5 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

6 Výchozí materiál dostatečně krátké homogenní úseky NA –rRNA, plasmidy, viry, organelová DNA zaklonování krátkých úseků DNA PCR amplifikace vhodného úseku

7 94°C 40°C 72°C 94°C cyklus 1 cyklus 2 cyklus 3 94°C, 40°C, 72°C 40°C, 72°C

8 Sekvenování dlouhých úseků shot gun strategie (strategie hrubé síly) DNA walking strategie –navrhování PCR primerů „Primer select“

9

10

11

12 Sekvenování dlouhých úseků shot gun strategie (strategie hrubé síly) DNA walking strategie –navrhování PCR primerů „Primer select“ přímá sekvenace x zaklonování fragmentů

13 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

14 Techniky Maxam-Gilbert (chemická) Sanger – (dideoxyribonukleotidová) Microarrays

15 Maxam-Gilbert metoda 5’-GATCAGGCTTAAGCA-3’ 3’-CTAGTCCGAATTCGT-5’ *P-GATCAGGCTTAAGCA dimethylsulfát piperidin kyselina mravenčí piperidin hydrazin piperidin hydrazin NaCl piperidin štípe před A a Gštípe před Gštípe před T a Cštípe před T *P-GATCA *P-GATCAG *P-GATCAGGCTTAA *P-G *P-GATC *P-GATCA *P-GATCAG *P-GATCAGGCTT *P-GATCAGGCTTA *P-GATCAGGCTTAA *P-GATCAGGCTAAGC *P-GA *P-GAT *P-GATCAGG *P-GATCAGGC *P-GATCAGGCT *P-GATCAGGCTTAAG *P-GAT *P-GATCAGG *P-GATCAGGCTTAA denaturace, radioaktivní značení

16 Maxam-Gilbert metoda II _ _ _ G A+GA+G T+CT+C C A C G A A T T C G G A CTCT A

17 Sanger metoda 5’-GTTTTCCCAGTCACGACAATCAGGCTTAAA-3’ 3’-CAAAAGGGTCAGTGCTGTTAGTCCGAATTT-5’ 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC ddATPddCTPddGTPddTTP primer-A primer-AA primer-AATCA primer-AATCAGGCTTA primer-AATCAGGCTTAA primer-AATCAGGCTTAAA primer-AATC primer-AATCAGGC primer-AATCAG primer-AATCAGG primer-AAT primer-AATCAGGCT primer-AATCAGGCTT příprava jednořetězcového templátu (denaturace) reasociace s primerem 5’-GTTTCCCAGTCACGAC-3’ syntéza řetězce (jeden nukleotid radioaktivní)

18 Sanger metoda II _ _ _

19 94°C 40°C 72°C G G G T G T G A A G C G T G A G T G A T GATACGAGTGGT

20 Automatická sekvenace – značené dideoxyribonukleotidy čtyři dideoxyribonukleotidy značené fluorescenčními značkami

21 Automatická sekvenace – značené primery primery značené fluorescenční značkou

22 Automatická sekvenace – PCR cyklická sekvenace dideoxyribonukleotidy značené fluorescenční značkou

23 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

24 Příčiny nejednoznačných výsledků přímá sekvenace: současná sekvenace několika úseků (repetitivní sekvence, cizorodá DNA, heteroplázie) –řešení: zaklonovat zaklonovaná DNA: PCR chyby –řešení: sekvenovat několik klonů

25 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

26 Manipulace s daty převedení do vhodného formátu „Chromas“ formát.SCF, „BioEdit“ spojování kontigu „Seqman“ (součást DNASTAR) kontrola kvality sekvence

27

28 Manipulace s daty převedení do vhodného formátu „Chromas“ formát.SCF, „BioEdit“ spojování kontigu „Seqman“ (součást DNASTAR) kontrola kvality sekvence ruční začisťování sekvence „BioEdit“

29

30 Explorační analýza získané sekvence Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice

31

32 Explorační analýza získané sekvence Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice vyhledávání homologických sekvencí v databázi Genbenk (NCBI), EMBL, PIR –„Blast“

33

34

35 Explorační analýza získané sekvence Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice vyhledávání homologických sekvencí v databázi Genbenk (NCBI), EMBL, PIR –„Blast“ v případě kódující sekvence překlad a kontrola produktu (BioEdit)

36 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

37 Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR

38

39

40

41

42 Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR alignment „Clustal X“, „Megalign“

43

44

45

46

47 Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR alignment „Clustal X“, „Megalign“ ruční dočištění alignovaných sekvencí „BioEdit“

48

49 Shrnutí Sekvenování je možno považovat za rutinní techniku molekulární fylogenetiky Klíčem k úspěchu je kvalitní výchozí DNA (čistota, délka, homogenita) Výběr vhodné techniky vyplývá z vybavení pracoviště a finančních možností Pozor na chyby a artefakty Osekvenováním práce nekončí, data nutno převést na znaky


Stáhnout ppt "Sekvenování. Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty."

Podobné prezentace


Reklamy Google