Sekvenování.

Prezentace na téma: "Sekvenování."— Transkript prezentace:

1 Sekvenování

2 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál
základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

3 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál
základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

4 Znaková dat sekvence čtyř nukleotidů v RNA či DNA
sekvence 20 aminokyselin v proteinu možnost převodu DNA na protein možnost převodu znakových dat na data distanční

5 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál
základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

6 Výchozí materiál dostatečně krátké homogenní úseky NA
rRNA, plasmidy, viry, organelová DNA zaklonování krátkých úseků DNA PCR amplifikace vhodného úseku

7 cyklus 1 cyklus 3 cyklus 2 40°C, 72°C 94°C 40°C 72°C 94°C, 40°C, 72°C

8 Sekvenování dlouhých úseků
shot gun strategie (strategie hrubé síly) DNA walking strategie navrhování PCR primerů „Primer select“

9

10

11

12 Sekvenování dlouhých úseků
shot gun strategie (strategie hrubé síly) DNA walking strategie navrhování PCR primerů „Primer select“ přímá sekvenace x zaklonování fragmentů

13 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál
základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

14 Techniky Maxam-Gilbert (chemická) Sanger – (dideoxyribonukleotidová)
Microarrays

15 Maxam-Gilbert metoda 5’-GATCAGGCTTAAGCA-3’ 3’-CTAGTCCGAATTCGT-5’
denaturace, radioaktivní značení *P-GATCAGGCTTAAGCA dimethylsulfát piperidin kyselina mravenčí piperidin hydrazin piperidin hydrazin NaCl piperidin štípe před G štípe před A a G štípe před T a C štípe před T *P-GATCA *P-G *P-GA *P-GAT *P-GATCAG *P-GATC *P-GAT *P-GATCAGG *P-GATCAGGCTTAA *P-GATCA *P-GATCAGG *P-GATCAGGCTTAA *P-GATCAG *P-GATCAGGC *P-GATCAGGCTT *P-GATCAGGCT *P-GATCAGGCTTA *P-GATCAGGCTTAAG *P-GATCAGGCTTAA *P-GATCAGGCTAAGC

16 Maxam-Gilbert metoda II
A+G T+C G C A + + + _ _ _ C G A A T T C G G A CT A

17 Sanger metoda příprava jednořetězcového templátu (denaturace)
5’-GTTTTCCCAGTCACGACAATCAGGCTTAAA-3’ 3’-CAAAAGGGTCAGTGCTGTTAGTCCGAATTT-5’ příprava jednořetězcového templátu (denaturace) 3’-CAAAAGGGTCAGTGCTGTTAGTCCGAATTT-5’ reasociace s primerem ’-GTTTCCCAGTCACGAC-3’ 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC 3’-CAAAAGGGTCAGTGCTGTTAGTCCGAATTT-5’ syntéza řetězce (jeden nukleotid radioaktivní) ddATP ddCTP ddGTP ddTTP primer-A primer-AATC primer-AATCAG primer-AAT primer-AA primer-AATCAGGC primer-AATCAGG primer-AATCAGGCT primer-AATCA primer-AATCAGGCTT primer-AATCAGGCTTA primer-AATCAGGCTTAA primer-AATCAGGCTTAAA

18 Sanger metoda II + + + _ _ _

19 T G 94°C T G A G T 40°C G A A G 72°C C G T G G A G G A T C G T

20 Automatická sekvenace – značené dideoxyribonukleotidy
čtyři dideoxyribonukleotidy značené fluorescenčními značkami

21 Automatická sekvenace – značené primery
primery značené fluorescenční značkou

22 Automatická sekvenace – PCR cyklická sekvenace
dideoxyribonukleotidy značené fluorescenční značkou

23 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál
základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

24 Příčiny nejednoznačných výsledků
přímá sekvenace: současná sekvenace několika úseků (repetitivní sekvence, cizorodá DNA, heteroplázie) řešení: zaklonovat zaklonovaná DNA: PCR chyby řešení: sekvenovat několik klonů

25 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál
základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

26 Manipulace s daty převedení do vhodného formátu „Chromas“ formát .SCF, „BioEdit“ spojování kontigu „Seqman“ (součást DNASTAR) kontrola kvality sekvence

27

28 Manipulace s daty převedení do vhodného formátu „Chromas“ formát .SCF, „BioEdit“ spojování kontigu „Seqman“ (součást DNASTAR) kontrola kvality sekvence ruční začisťování sekvence „BioEdit“

29

30 Explorační analýza získané sekvence
Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice

31

32 Explorační analýza získané sekvence
Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice vyhledávání homologických sekvencí v databázi Genbenk (NCBI), EMBL, PIR „Blast“

33

34

35 Explorační analýza získané sekvence
Dotplot (BioEdit), přímé a reverzní repetice vyhledávání homologických sekvencí v databázi Genbenk (NCBI), EMBL, PIR „Blast“ v případě kódující sekvence překlad a kontrola produktu (BioEdit)

36 Obsah charakter získávaných dat výchozí materiál
základní sekvenační strategie sekvenační techniky zdroje chyb v sekvenci manipulace s daty převod dat na znaky

37 Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR

38

39

40

41

42 Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR alignment „Clustal X“, „Megalign“

43

44

45

46

47 Převod dat na znaky doplnění o sekvence z databází Genbank (NCBI), EMBL, PIR alignment „Clustal X“, „Megalign“ ruční dočištění alignovaných sekvencí „BioEdit“

48

49 Shrnutí Sekvenování je možno považovat za rutinní techniku molekulární fylogenetiky Klíčem k úspěchu je kvalitní výchozí DNA (čistota, délka, homogenita) Výběr vhodné techniky vyplývá z vybavení pracoviště a finančních možností Pozor na chyby a artefakty Osekvenováním práce nekončí, data nutno převést na znaky