Hmotnostní spektrometrie (2) Josef Chudoba

Využití MS - kvalitativní analýza Electron Impact ionizace (EI + 70 eV) Databáze spekter GC/MS LC/MS MS/MS experimenty Využití MS - kvantitativní analýza Kalibrace technikou s vnitřním standardem Úprava vzorků pro MS analýzy SPE, SPME, extrakce ……. Speciální aplikace MS ICP-MS, Isotope Ratio MS

Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Ionty vznikají interakcí molekuly s proudem elektronů o definované energii (70 eV) Molekulový ion – lichý počet počet elektronů Ionizační energie (IE) – energie nutná k odtržení elektronu z molekuly Neutrální molekula – sudý počet elektronů

Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Molekulový ion  informace o hmotnosti popř. chemickém složení látky, ion s lichým počtem elektronů, jeho m/z nejvyšší v MS spektru (mimo ionty izotopických příspěvků a pozadí); v MS spektru existují také nižší fragmenty s m/z molekulového iontu zmenšenou o logickou ztrátu neutrálních molekul a fragmentů Povolené ztráty m/z Zakázané ztráty m/z 4 - 14, 21 - 25 15  CH3- 18  H2O 28  C2H4 nebo CO 35  Cl 36  HCl Jsou-li přítomny tyto fragmenty v MS spektru , sledovaný ion určitě není molekulární. Podle intenzity izotopických fragmentů  lze poznat přítomnost Cl, Br, lze zjistit počet atomů uhlíku fragmentu R+DB musí být celé číslo (R+DB = C -1/2 H + 1/2N +1)

Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Fragmentace molekulového iontu a dalších vzniklých iontů Homolytické štěpení Heterolytické štěpení Přesmyky

Elektronová ionizace (EI + 70 eV) Fragmentace EI+ 70 eV 120 – 91 = 29 Ztráta neutrální částice (molekuly nebo radikálu) z rozdílů hmot píků se získají tzv. neutrální ztráty  vypovídají o struktuře molekuly

Běžné neutrální ztráty EI+ (70 eV) ionizace

Série nízkých iontů (1) - EI+ (70 eV) ionizace

Série nízkých iontů (2) - EI+ (70 eV) ionizace

EI + 70 eV: MS spektra - alkany n-dekan C4H9+ C3H7+ inkrement CH2 C5H11+ C6H13+ C7H15+ C8H17+

EI+ 70 eV: MS spektra alkanů (2) n-alkan iso-alkan iso-C8 n-C8 iso-C8 n-C22

EI+ 70 eV:MS spektra alkenů a cykloalkanů alkylcyklopentan alken alkylcyklohexan MS spektra alkenů jsou podobná cykloalkánům

EI+70 eV: MS spektra aromátů alkylsubstituované benzeny chudší fragmentace  stabilní arom. kruh, fragmenty z alkylu  nejintenzivnější píky  91 / 92 (tropilium) molekulový ion (toluen 92, xyleny 106, triMeBenzeny 120, atd.) butylbenzen benzen M+ 78 M+ 134

EI+ 70 eV: MS spektra polyaromátů Benzo(a)pyren M+ = 252 M+/2 = 126 Benzo(b)fluoranthen M+ = 252 geometrické izomery PAU prakticky nelze rozlišit pomocí MS intenzivní molekulový iont M+ (m/z ; z=1) + 2x nabitý mol. iont (m/z ; z=2) POZOR !!! nejedná se o fragment!!!

EI+ 70 eV:MS spektra alkoholů 1-hexadecanol m/z 31 1-hexadecen Alkoholy – podobná spektra jako alkeny, lze je rozlišit podle iontu m/z 31 (alkeny nemají), mají navíc velmi malý molekulový ion, nebo úplně chybí

EI+70 eV: MS spektrum - aromatický alkohol molekulový ion benzylalkohol inkrement OH inkrement CH2OH m/z 109 M+1  izotop 13C fenyl+ tropylium+

EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky - amíny Triethylamin Anilin

EI+70 eV: MS spektrum – dusíkaté látky - nitrosloučeniny 2,4,6 - trinitrotoluen RDX plastická trhavina M = 222 Da

EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter Univerzální komerční databáze National Institute of. NIST 05 190 825 spekter Standards and Techn (163 198 sloučenin) John Wiley & Sons Wiley Registry 8th Ed. 399 383 spekter Pallisade MS Pallisade Complete > 600 000 spekter Oborové komerční databáze John Wiley & Sons Biomarkes 1110 spekter John Wiley & Sons Steroids 2979 spekter Oborové free-ware databáze American Academy of Forensic Science (AAFS) “Comprehensive drug LIbrary “(http://www.ualberta.ca/~gjones/mslib.htm) The Int. Association of Forensic Toxicologosts (TIAFT) “Derivatives of Drugs “(http://www.tiaft.org/main/mslib.html)

EI+ 70 eV: Knihovny MS spekter – počítačové vyhledávání Změřené MS spektrum je porovnáváno s databázovými spektry podle různých algoritmů PBM - Probability Based Matching (McLafferty & Stauffer) – rok 1976 Dot Product (Finnigan/INCOS) – rok 1978 Mass Spectral Tree Search (Mistrik) – od roku 2000 (pro MS/MS experimenty, LC/MS aplikace) Weighted Dot Product (Stein) – od r. 1993 algoritmus součástí NIST SEARCH programu Forward search – porovnává všechny píky spektra, nejvíce podobná spektra přiřadí Reverse search – nebere v úvahu všechny píky měřeného spektra, píky, které se neshodují s přířazeným databázovým spektrem ignoruje

EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Výsledkem porovnání měřeného MS spektra s databázovými je několik spekter (HITů) - o kvalitě knihovního nálezu vypovídá tzv. MATCH factor (0-999) – vyšší hodnota – lepší shoda

Podobné látky mohou mít odlišná MS spektra, ale … EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!! Podobné látky mohou mít odlišná MS spektra, ale …

Ale odlišné látky mohou mít i podobná MS spektra EI+70 eV: Identifikace podle databázových MS spekter Vysoký MATCH faktor nemusí vždy znamenat správný výsledek !!! Ale odlišné látky mohou mít i podobná MS spektra

GC/MS: pomoc při identifikaci Kovatsův retenční index (RI) RI = 100n + 100[log(tx) − log(tn)] / [log(tn+1) − log(tn)] n-C16 n-C17 n … počet atomů uhlíku n-alkánu před sloučeninou X tn … retenční čas n-alkánu před sloučeninou X tn+1 … retenční čas n-alkánu za sloučeninou X tx … retenční čas sloučeniny X log .. přirozený logaritmus n-C15 n-C18 tn tn+1 n-C14 tx Hodnoty RI jsou dostupné pro celou řadu látek a podmínek – fáze GC kolony (nepolární vs polární), teplotní program separace atd. http://webbook.nist.gov/chemistry/ NIST 05 MS knihovna

LC/MS: kvalitativní analýza Sprejové ionizační techniky poskytují pseudomolekulové ionty resp. adukty molekulového iontu s některými kationty (pozitivní režim) nebo anionty (negativní režim). Často vznikají při ionizaci i oligomery sloučenin nebo v ESI vícenásobně nabité ionty. Pozitivní režim Negativní režim M + 1 (H+) M - 1 ( - H+) Možné adukty Možné adukty M + 23 (Na+) M + 39 (K+) M + 32 (CH3OH) M + 41 (CH3CN) M + 22 (Na+ -H) M + 45 (COOH-) M + 59 (CH3COO-) M + 58 (NaCl) M + 41 (CH3CN)

LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty Velké molekuly (ESI) – série iontů – nestejné rozdíly mezi m/z – příklad koňský myoglobin (M = 16951 Da) Určení náboje a celkové hmotnosti molekuly: m1 a m2 .. m/z dvojice sousedních iontů, n1 a n2 jejich náboj (z), X adukt k molekulovému iontu m1 = [M+n1X]/n1 m2 = [M+n2X]/n2 n2 = (m1-X)/(m2-m1) m1 = 1413, m2 = 1542, odhad X = 1 n2 = 10.94 , Mcalc = 16951 Da m1 = 1305, m2 = 1413, odhad X = 1 n2 = 12.07, Mcalc = 16944 Da

LC/MS: kvalitativní analýza Vícenásobně nabité ionty malé molekuly – příklad dvounásobně nabitý ion – poloviční rozdíl u m/z mezi izotopy [M+2H]2+ z = 1 z = 2 C156 H204 N8 O18 D 1 Da D 0,5 Da M = 2477,5292 Da [M+H]+ = 2478,5372 Da [M+H]+

kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik APCI+ [M+H] +

kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik ESI+ [M+Na] +

kvalitativní analýza – kombinace více ionizačních technik EI+ 70 eV

LC/MS/MS: kvalitativní analýza Lze měřit jen s IT, QqQ, nebo hybridními MS spektrometry (Q-TOF,IT-Orbitrap) 1.Separátor výběr iontu -> „definované rozbití” iontu v kolizní cele -> analýza produktů 2. analyzátorem APCI pos MS spektrum MS2 -MS/MS z [M+H]+ [M+H]+ MS3 - MS/MS z m/z 523

LC/MS/MS: kvalitativní analýza Aby se rozdělily jen podle m/z muselo by být R = 740 000 C15H31N5O6Cl2 + H m/z 448,1730 C24H27NO6 + Na m/z 448,1736 Zdroj: Shimadzu LCMS-IT-TOF brochure

MS: Kvantitativní analýza CÍL: Potvrzení, že jde skutečně o sledovaný analyt Zjištění jeho koncentrace ve vzorku Ad 1: většinou se jedná o chromatografické analýzy (GC/MS resp. LC/MS) – znám retenční čas (RT) EI+ 70 eV: TIC režim (menší citlivost) – pro identifikaci k dispozici celé MS spektrum SIM režim (vyšší citlivost) – vždy je lépe snímat alespoň dva charakteristické ionty (identifikaci může potvrdit poměr jejich odezev) ESI, APCI: MRM (Multiple Reaction Monitoring) – MS/MS technika – 1 analyzátor SIM (výběr iontu) – 2. analyzátor kolize – 3. analyzátor SIM (více iontů, sleduje se poměr odezvy)

LC/MS/MS: Kvantitativní analýza Příklad využití MRM Izotopicky označený standard – stejné retenční chování, jiná molekulová hmotnost – používá se jako vnitřní standard (Internal Standard – IS) Kvalitativní informace: retenční čas a přítomnost dceřinného iontu (m/z) popř. poměr ploch píků stop více dceřiných iontů Kvantitativní informace: plocha píků dceřinného popř. dceřiných iontů (m/z) pro analyt a vniřní standard Zdroj: Agilent technologies 5989-9665 App. Note

MS: Kvantitativní analýza Kalibrační přímka Analyt (Plocha A) Vnitřní standard (Plocha Ais) A/Ais c/cis c .. Koncentrace A/Ais = RRF . c/cis Směrnice přímky je RRF RRF .. Relativní odezvový faktor Kalibrace s použitím vnitřního standardu Přítomnost vnitřního standardu snižuje vliv kolísání odezvy MS detektoru, u GC chybu při nástřiku atd., jako vnitřní standard lze použít i podobnou sloučeninu ne izotopicky značenou

MS: Kvantitativní analýza Signál (signal) Kalibrační rozsah A/Ais c/cis Šum (noise) LOD ~ 3 x (Anoise/Ais) / RRF LOQ ~ 10 x (Anoise/Ais) / RRF Mez detekce (Limit of Detection - LOD) Mez stanovitelnosti (LOQ - Limit of Quantification)

MS: Kvantitativní analýza – citlivost MS spektrometrů Specifikace výrobce: pro konkrétní sloučeninu a podmínky – udává se poměrem signál/šum pro absolutní detekované množství sloučeniny – zpravidla se jedná o množství v řádu pikogramů (pg = 10-12g) nebo femtogramů (fg = 10-15g) C10F8 GC/MS: splitless nástřik: 1 pg oktafluorunaftalenu (OFN) – SIM režim m/z 272 - S/N > X LC/MS/MS: FIA: ESI+ 100 fg reserpine MRM: m/z 609 ->m/z 397 a 447 S/N > X C33H40N2O9 Nejmenší absolutní detekované množství : SIM (MRM): řádově fg-pg TIC (Full Scan): řádově pg-ng Maximální abs. detekované množství: dané dynamickým rozsahem cca 3-5 řádů tzn. SIM (MRM) ng ;TIC (Full Scan) mg vždy však záleží na typu sloučeniny – odezva MS detektoru není univerzální

Předúprava vzorků Cíl: zjednodušení matrice vzorku (odstranění interferujících sloučenin) zakoncentrování analytu ve vzorku změna rozpouštědla např. voda není vhodná pro GC/MS analýzu Způsoby předúpravy: filtrace centrifugace zakoncentrování odpařením extrakce (rozpouštědlová, Soxhlet) SPE (Solid Phase Extraction) Purge and Trap SPME (Solid Phase Microextraction) Pro těkavé sloučeniny (VOC)

Předúprava vzorků: SPE – Solid Phase Extraction Vzorek (analyt s matricí) je nanesen na kondiciovanou vrstvu sorbentu. Matrice je oddělena a zakoncentrovaný analyt je eluován malým objemem vhodného rozpouštědla. Normální uspořádání fází Polární sorbent, nepolární rozpouštědlo Reverzní uspořádání fází Nepolární sorbent, polární rozpouštědlo Iontová výměna pro iontové sloučeniny

Předúprava vzorků: SPME (Solid Phase Microextraction) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z plynných matricí nebo těkavých a semitěkavých sloučenin z vody Vlákno: polymerní sorbent na nosiči: Carboxen 75 mm/ Poludimethylsiloxan (PDMS) 85 mm těkavé látky Mw 30 – 225 Da PDMS 100 mm těkavé látky Mw 60 – 275 Da PDMS 30 mm semitěkavé nepolární Polyakrylát (PA) 85 mm semitěkavé polární Kompatibilita s vodnou matricí

Předúprava vzorků: Purge and Trap (P-T) Slouží pro zakoncentrování a analýzu těkavých sloučenin z vody Vzorek je vystripován z vody proudem plynu (dusík, He) a organické látky jsou sorbovány na sorbent Sorbent je desorbován, organické látky zakoncentrovány a přeneseny na GC kolonu

ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Stopová analýza prvků (kovů)

ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) Způsob dávkování vzorku: Kapalina: tvorba aerosolu Pevné látky: Laserová ablace

ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie) ICP torch – tvorba iontů

ICP-MS (Indukčně vázaná plazma – hmotnostní spektrometrie)

ISOTOPE RATIO MASS SPECTROMETRY Využití v geologii, archeologii, kriminalistice Organická látka je katalyticky spálena na CO2 (CuO/Pt~ 800°C), voda je odstraněna přes NAFION membránu a CO2 je detekován pomocí MS (obvykle dva detektory jeden na 13 CO2 m/z 45 a druhý na 12 CO2 m/z 44) Standartní ref. látka – CaCO3 Pee Dee Belemnite (PDB) – rozkladem CO2 s poměrem pPDB =13C/12C = 0,01123 d 13C = 1000 * (pvzorek – pPDB)/pPDB CO2 výdech lidi USA CO2 výdech lidi Evropa Fosilní paliva CO2 atmosféra Methan atmosféra PDB Fosilní paliva