Sekvencování Sangerova metoda - dideoxyterminátory O PPP H OH H OH H H 5´ 3´ NTP N N N N NH 2 O PPP H H H OH H H 5´ 3´ dNTP N N N N NH 2 O PPP H H H H.

Prezentace na téma: "Sekvencování Sangerova metoda - dideoxyterminátory O PPP H OH H OH H H 5´ 3´ NTP N N N N NH 2 O PPP H H H OH H H 5´ 3´ dNTP N N N N NH 2 O PPP H H H H."— Transkript prezentace:

1 Sekvencování Sangerova metoda - dideoxyterminátory O PPP H OH H OH H H 5´ 3´ NTP N N N N NH 2 O PPP H H H OH H H 5´ 3´ dNTP N N N N NH 2 O PPP H H H H H H 5´ 3´ ddNTP N N N N NH 2

2 Dideoxyterminátory O PPP H H H H H H 5´ 3´ N N N N NH 2 FLU O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU N N N N O NH 2 N N O NH 2 N N O O CH 3

3 Průběh sekvencování 1. denaturace (92-96°C) 2. annealing (45-72°C) dsDNA 3. extenze (72°C)

4 Průběh sekvencování 1. denaturace (92-96°C) 2. annealing (45-72°C) dsDNA 3. extenze (72°C)

5 Průběh sekvencování 1. denaturace (92-96°C) 2. annealing (45-72°C) dsDNA 3. extenze (72°C)

6 Zařazování ddTTP ATGCTACGTTTAGCCACATTTGCCATATGAACCT TGCAAA O PPP H H H H H H 5´ 3´ FLU N N O O CH 3 TGCAAATCGGTGT TGCAAATCGGT TGCAAAT TGCAAATCGGTGTAAACGGT

7 Zařazování dalších ddNTP ATGCTACGTTTAGCCACATTTGCCATATGAACCT TGCAAA TGCAA TGCA TGCAAATCGGTGTA ATGCTACGTTTAGCCACATTTGCCATATGAACCT TGCAAATCC TGCAAATC TGC TGCAAATCGGTGTAAAC

8 Výsledek sekvencování TGCAAA TGCAA TGCA TGCAAATCGGTGTA TGCAAATCC TGCAAATC TGC TGCAAATCGGTGTAAAC TGCAAA TGCAAATCGGTGT TGCAAATCGGT TGCAAAT TGCAAATCGGTGTAAACGGT TGCAAATCG TGCAAATCGG TGCAAATCGGTG TGTG

9 Purifikace produktů Komerční souprava „DyeEx 2.0 Spin Kit“  pryskyřice  odstraní dideoxyterminátory  odstraní anorganické zbytky reakce

10 Kapilární elektroforéza Genetic Analyzer 3130 Applied Biosystems  rozdělí produkty sekvencování podle velikosti  detekuje fluorofory laserem