Základní mikrobiologický rozbor vody Mgr. Petra Straková Podzim 2014

Voda Přirozené stanoviště mikroorganismů Sladká/slaná voda, i extrémní podmínky Prostředek pro transport živin – příjem/vylučování, veliký rozmach průmyslu, vysoká koncentrace lidí, chemizace v zemědělství – znečištění !!! Vždy určité množství mikroorganismů Zastoupení vlivem různých faktorů kolísá

Sladká voda Nejpřirozenější Zastoupení závislé na zdrojích N, C a na přítomnosti kyslíku 3 skupiny mikroorganismů: autochtonní půdní střevní

Autochtonní mikroorganismy Přirození obyvatelé Složení stálé a stabilní Chromobacterium, Spirillum

Půdní mikroorganismy Do vody se dostanou splavováním Pobřeží Počet závisí na množství organické hmoty Bacillus, Streptomyces

Střevní mikroorganismy Fekální znečištění Krátkodobý výskyt (i patogenů) Enterobacteriaceae (E.coli, Salmonella, Shigella), Streptococcus, Enterococcus

Diagnostika 1) Psychrofilní bakterie 2) Mezofilní bakterií 3) Koliformní bakterie 1+2 = obecné znečištění 3 = fekální znečištění

Psychrofilní bakterie Optimální teplota do 20 °C Indikace přítomnosti organických látek rychle rozložitelných bakteriemi Stanovení jen v případě, že vodu povrchovou chceme převést na pitnou Pitná voda: <200 bakterií na 1ml Studny, povrchové vody: <500 bakterií na 1 ml

Mezofilní bakterie Rostou při teplotě 37 °C Indikace znečištění mikroflórou teplokrevných živočichů a člověka I patogenní organismy !! Pitná voda: <20 bakterií na 1 ml Studna, povrchové vody: <100 bakterií na 1 ml

Fekální znečištění jako indikace se považuje průkaz E.coli a intestinálních enterokoků Koliformní bakterie – obyvatelé tlustého střeva, G- tyčky (nejčastěji E.coli) Když určíme fekální znečištění, musíme rozbor rozšířit o stanovení střevních patogenů (lac- Shigella, Salmonella; lac+ E.coli) G+ - Enterococcus – čerstvé fekální znečištění exotická zajímavost: Vibrio, Legionella, Aeromonas Pitná voda: 0 bakterií na 1 ml Studna, povrchové vody: 0 bakterií na 1 ml

Cíl cvičení Stanovení celkového počtu bakterií – TYEA půda (20 °C, 37 °C) Stanovit indikátorové skupiny bakterií – ENDO, mFC, SB agar Posouzení kvality vody – místo odběru, včasný rozbor, stanovení indikátorů (ne všechny MO), státní normy

Půdy ENDO – selektivně diagnostická půda, fuchsin – inhibuje G+, koliformní bakterie pak červené zbarvení (lac+), lac- růžové kolonie (obligátní paraziti – Yersinia) Kultivace při 37 °C

Půdy mFC – selektivně diagnostická půda, soli inhibují G+, lac+, termotolerantní bakterie – modře zbarvené Kultivace při 44 °C Teplotní test na znečištění

Půdy SB agar (Slanetz-Bartley) – selektivní pro enterokoky – azid sodný, indikátor TTC – červeně zbarvené kolonie Kultivace 37 °C/44 °C

Postup (ve dvojicích) 1) Odběr – do sterilních lahví, sterilita práce, zpracování ihned nebo krátkodobě v lednici 2) PITNÁ VODA – neředěný vzorek a 10-1 POVRCHOVÁ VODA – ředění 10-1 a 10-2 POŘÁD PROMÍCHÁVAT VODU!!! 0,5 ml 0,5ml 10-1 10-2 VZOREK 4,5 ml fosfátového pufru

NEJDŘÍV POPSAT MISKY ZESPODU !! (jméno, půda, teplota, ředění) Postup (ve dvojicích) 3) TYEA – 2 misky v každém ředění 20 °C, 2 misky v každém ředění 37 °C (=8) - 200 µl pipetovat na misku a rozhokejkovat 4) ENDO, SB, mFC – 2 misky v každém ředění (=4) - 200 µl pipetovat na misku a rozhokejkovat NEJDŘÍV POPSAT MISKY ZESPODU !! (jméno, půda, teplota, ředění)

Půdy, kultivace a hodnocení Indikátorová skupina Půda Kultivace Barva kolonií Všechny MO TYEA 20, 37°C Všechny kolonie Koliformní MO ENDO 37 °C Sytě červené s kovovým leskem Termotolerantní MO mFC 44 °C Modré kolonie enterokoky SB Červené kolonie

Hodnocení TYEA – spočítáme všechny narostlé kolonie - spočítáme průměr u daného ředění, např.: 21 x 101 x 10 Počet kolonií – průměr ze 2 misek při daném ředění Hodnota pro celý 1 ml Hodnota ředění (kladný index)

Hodnocení ENDO agar – červené s kovovým leskem (E.coli), ostatní lac+ - tmavě červené, lac- - růžové/průhledné kolonie SB agar – červené, tmavě červené kolonie mFC – fialové až tmavě modré kolonie VÝSLEDKY POROVNAT S NORMAMI !!

Problémy rozboru Odběr ! Kontaminace, soustavné míchání, ředění Očkování média – staré, kontaminované médium, aseptická práce, vliv inkubační doby a teploty Odečet výsledků – u pitné vody –KAŽDÁ kolonie se počítá , u povrchové vody – řeší se počet kolonií i ty podezřelé !