Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Metody separace proteinů. Literatura Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky Ferenčík : Biochemická laboratorní technika Scopes.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Metody separace proteinů. Literatura Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky Ferenčík : Biochemická laboratorní technika Scopes."— Transkript prezentace:

1 Metody separace proteinů

2 Literatura Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky Ferenčík : Biochemická laboratorní technika Scopes : Protein Purification Harris : Protein Purification Methods – Practical Approach Deutcher : Guide to Protein Purification Janson : Protein Purification Kastner : Protein Liqiud Chromatography

3 Metody separace proteinů Vychází z klasických metod chemické analýzy Uplatňují se zde i speciální metody

4 Separace kvalitativní Analytické kvantitativní Preparativní Charakterizace – pI, MW, spektra, AMK ….

5 Problémy se vzorkem Komplexnost Malá množství Labilita

6 Zásady pro práci s biologickým materiálem 1.Teplota 2.pH + iontová síla 3.Koncentrace bílkoviny 4.Pěnění 5.Lokální přebytky 6.Proteázy

7 Plánování separace bílkovin

8 Cíl izolace Získání homogenní bílkoviny Zachování biologické aktivity Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí

9 Volba vstupního materiálu Preparát z daného organismu Preparát s největším obsahem dané bílkoviny Preparát s nejmenším obsahem nečistot

10 Volba a kombinace separačních metod Rozlišovací schopnost Selektivita Kapacita Zpětný výtěžek Náklady – materiál, přístroje, člověk Stupeň zřeďování a koncentrace Slučitelnost mezi metodami

11 Základní zásady Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením  velké množství levného vstupního materiálu Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná  ve vzorku již investovaná práce

12 Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími Metody nepoužívat opakovaně

13 Sledování průběhu separace MetodaCelková bílkovina Celková aktivita Specifická aktivita PřečištěníVýtěžek extrakt % HIC % IEX %

14 Stanovení koncentrace bílkoviny

15 Kjeldahlova metoda – stanovení N 2 Mineralizace vzorku – převedení organického dusíku na NH 4 + Stanovení NH titrace, fotometrie, selektivní elektrody

16 UV spektrofotometrie 280 nm – aromatické AMK interference nukleotidů nm – peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace

17 VIS spektrofotometrie Přídavek činidla  barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost

18 Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu 2+ Měření : 540 – 560 nm 310 nm

19 Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm

20 Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm

21 Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm

22 Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu na bílkovinu  měření vzniklé fluorescence - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny

23 Polarografie Princip : Brdičkova reakce – SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co 2+ katalytické reakce na Hg elektrodě  proud

24 Nejčastěji používané metody MetodaRozsah (ng)Poznámka Biuretová okamžitý vývoj Lowryho pomalý vývoj UV nm interference UV – 205 nm interference Bradfordové sorpce barviva

25 Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd..

26 Vlastní separace

27 Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace

28 Vstupní materiál

29 Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy

30 Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává

31 Živočišné tkáně Laboratorní zvířata – myši, krysy, králíci Jateční zvířata – orgány Člověk – tělní tekutiny

32 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda – problematický růst za definovaných podmínek

33 Manipulace s biologickým materiálem Pokud možno zpracovat co nejdříve Zmražení – při – 60 – 80 o C Rozmrazování – co nejrychleji

34 Rozbití a extrakce

35 Bakterie Záleží na lokalizaci cytoplasma periplasma

36 Balotina Princip – jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy – nutno chladit

37 French (X) press Princip – zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk

38 Ultrazvuk Princip – ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly – nutno chladit

39 Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip – lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H 2 O – bakterie popraskají

40 Další Alumina Al 2 O 3 – roztírání v třecí misce Opakované zmražování a rozmražování

41 Kvasinky Toluenová autolýza Princip – toluen extrahuje při 35 –40 o C fosfolipidy buněčné stěny  osmotický šok  enzymová autolýza Balotina, French press,

42 Živočišné tkáně Třecí miska s pískem Ruční homogenizatory – Potter – Elvehjemův Mixery Osmotická lyse - erytrocyty

43 Rostlinné tkáně Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony – melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny

44 Optimalizace extrakce Teplota – 4 – 6 o C chlazení pH – optimální pro danou bílkovinu – práce v pufrech I – v prostředí o definované iontové síle Přídavky látek – EDTA,  -merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteáz

45 Separace subcelulárních organel OrganelaTíhové zrychleníČas Eukar.buňky1 000 g5´ Jádra, chloroplasty4 000 g10´ Mitochondrie, bakterie g20´ Lysozomy, membrány g30´ Ribozomy, fragmenty end.retikula a Gold.systém g60´

46 Enzymy - markery OrganelaEnzym CytoplasmaLDH Endoplazmatické retikulumGlukosa-6-fosfatasa Goldiho systémgalaktosyltransferasa Peroxisomkatalasa LysozomKyselá fosfatasa Mitochondrie incytochromoxidasa Mitochondrie outmonoaminoxidasa

47 Membránově vázané bílkoviny

48 Izolace membránových bílkovin Chemicky – detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla, Fyzikálně - homogenizace, sonikace Enzymaticky – fosfolipasy, lipasy, proteasy

49 Centrifugace Odstranění hrubých částic z roztoku Sediment (pelet) – supernatant Izolace organel nebo biomakromolekul Stanovení základních parametrů – MW, hustota, sedimentační koeficient

50 Použití

51 Otáčky  g rad  - uhlová rychlost (rad/s) f – otáčky/min

52 Rozdělení centrifug

53 Preparativní centrifugace

54 Metody nanášení vzorku

55 Preparativní centrifuga

56

57 Preparativní ultracentrifuga

58 Rotory Úhlový – diferenciální centrifugace Výkyvné – zonální centrifugace Zonální – bez kyvet, vzorek je uvnitř rotoru

59 Úhlový rotor

60 Výkyvný rotor

61 Gradientová centrifugace média Sacharosa Glycerol Ficoll - dextran Percoll – SiO 2 CsCl – gradient vzniká během centrifugace Hypertonické prostředí Nutno připravit gradient

62 Gradientová centrifugace

63

64 Zonální rotor

65 Centrifugace se zonálním rotorem

66 Analytická ultracentrifuga

67

68 Kyveta

69 Analytická centrifugace

70 Analytická ultracentrifugace

71 Metoda sedimentační rovnováhy

72 Metoda sedimentační rychlosti

73 Fázové separace

74 Odstranění H 2 O rotační vakuová odparka

75 Odstranění H 2 O lyofilizace Namražení Mrazová sublimace

76 Odstranění H 2 O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Vzduch - pervaporace xerogely Látky s afinitou k H 2 O

77 Odstranění H 2 O zahuštění Použití semipermeabilní membrány

78 Odstranění H 2 O zahuštění Použití semipermeabilní membrány

79 Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza

80 Stanovení interakčním konstant Rovnovážná dialýza

81 Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit

82 Ultrafiltrace míchané cely

83 Ultrafiltrace centrifugační přípravky

84 Ultrafiltrace Hollow fiber – dutá vlákna

85 Ultrafiltrace Hollow fiber – dutá vlákna

86 Příprava laboratorní vody

87 Nečistoty ve vodě Soli – těžké kovy - denaturace Organické látky – HPLC, GC Hrubší částice – mikroorganismy Koloidní částice - biomakromolekuly

88 Kriteria čistoty Vodivost – 18 M  /cm Těžké kovy – AAS Pyrogenita

89 Postupy čistění destilace Destilace – teoreticky odstraní všechny složky, prakticky jsou strhávány těžké kovy z elektrod (Cu, Zn, Fe) Redestilace – křemenné aparatury Nevýhoda – náklady na vodu a elektrickou energii

90 Postupy čistění reverzní osmoza Nevýhoda – malá kapacita, nevyčistí úplně

91 Postupy čistění deionizace Kolony se směsnými ionexy – katex + anex

92 Postupy čistění elektrodeionizace

93 Postupy čistění odstraňování org. látek Speciální patrony s aktivním uhlím a jinými sorbenty UV – 180 nm nm - oxidace org. látek, - likvidace bakterií

94 Postupy čistění filtrace Membránová – vetší póry – bakterie Ultrafiltrace – malé póry - koloidní částice

95 Kaskádový systém kombinace

96 Millipore


Stáhnout ppt "Metody separace proteinů. Literatura Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky Ferenčík : Biochemická laboratorní technika Scopes."

Podobné prezentace


Reklamy Google