Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1  suspenze  emulze  koloidní roztoky (NK, bílkoviny)

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1  suspenze  emulze  koloidní roztoky (NK, bílkoviny)"— Transkript prezentace:

1 4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1  suspenze  emulze  koloidní roztoky (NK, bílkoviny)

2 Rychlost sedimentující částice v Frikční koeficient Stokesův zákon Relativní odstředivé zrychlení R – násobek g sedimentační koef. s [sec] x sedimentační konst. →Extrapolace na C 0 →20 o C →H 2 O N = r.p.m.

3 Svedbergova jednotka 1S=1x10 -13 sec

4 4.1. METODY 4.1.1. DIFERENCIÁLNÍ CENTRIFUGACE metoda pohyblivého rozhraní Dělení podle S Podmínka : ΔS max.; S max na dno (≈ t, N) Výhody: Jednoduché Nevýhody: Pouze 1 složka STĚNOVÝ EFEKT – nedokonalé dělení

5 4.1.2. CENTRIFUGACE V KONCENTRAČNÍM GRADIENTU ZONÁLNÍ Gradient Kontinuální Diskontinuální Sacharosa Dextran FICOL ρ ≥ 1,3 g/cm 3

6 4.1.2. ZONÁLNÍ CENTRIFUGACE a. RYCHLOSTNÍ b. IZOPYKNICKÁ c. IZOPYKNICKÁ ROVNOVÁŽNÁ- automatické vytváření gradientu ( CsCl ρ≤1,9; F 3 AcOCs ρ≤2,6 g/cm 3 ) Výhody Dokonalejší dělení Nevýhody Malé množství Separace zón obtížná (propíchnutí) Stěnový efekt ρ < ρ č S ≈ r 2 ρ > ρ č ρ RYCHLOSTNÍ IZOPYKNICKÁ

7 Centrifugační zkumavky Skleněné Z umělé hmoty: Ependorfky Zkumavky s víčkem QUICK – SEAL polyallomer tubes

8 4.2. TYPY ODSTŘEDIVEK

9 4.2.1. DISKONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY a. Se závěsnými kyvetami α = 90 o V = 30 ml – 3 l, N = 3 – 10 000 S úhlovým rotorem b. α = 14 -40 o c. α = 0 o N =33 000 Výhody: Nevýhody: Krátká dráha Zvíření Úzká zóna s výměnným rotorem

10 Výměnné rotory Beckman

11

12

13

14 d. se zonálním rotorem 1.Jádro rotoru s přívody 2.Jádro s rameny 3.Stěna rotoru V rotoru = 0,6 – 1,6 l V vzorku = 20 – 200 ml 4. Gradient hustoty 5.Podložní roztok – cushion 6.Překrývající roztok – overlay Postup 1.Plnění N = 10 3 ot/min 2.Dělení centrifugací N = 10 4 ot/min 3. Vytlačování N = 10 3 ot/min

15 Čištění transformační DNA z b.subtilis centrifugací v zonálním rotoru 27 mg surové DNA/15 ml Gradient sacharosy 5-30% Citrátový pufr pH 7,0 Cushion – 50 ml 42% sach. Overlay – 100 ml pufru Plnění - 2 000 ot/min Dělení – 40 000 ot/min 7 hod Jímané frakce 10 ml Bílkoviny + RNA DNA agregáty DNA 2,5 S 26 -35 S

16 4.2.2. KONTINUÁLNÍ ODSTŘEDIVKY Typ SHARPLES N = 40 000 ot./min Výhoda: Velká kapacita 20 – 50 l/hod. Suspenze i emulze Průmyslové kaly

17 4.3. POUŽITÍ CENTRIFUGACE Centrifugace – nejčastější metoda, nejdůležitější Separace (čištění) průmyslové kaly, emulze,  bílkoviny, NK, organely, buňky, viry, Diferenciální – počátek separace, zpracování homogenátů tkání, náhrada FILTRACE Zonální – dokonalejší, frakcionace Analýza - M

18 )

19 4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE 20.léta Svedberg a j.: důkaz – makromolekuly ne agregáty, ale spojeny kovalentními vazbami  rozvoj chemie makromolekul 1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL: důkaz semikonzervativní replikace DNA  rozvoj molekulární biologie Expanze a útlum AU Vzkříšení v 90. letech: kombinace moderních přístrojů a počítačového softwaru pro zpracování dat AU SV – sedimentační rychlost: S a hydrodynamické vlastnosti SE – sedimentační rovnováha: M, K asociace

20 Důkaz semikonzervativní replikace DNA 1958 Mathew MESSELSON + Franklin STAHL

21 4.4.2. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGA

22 Analytická centrifuga BECKMAN –COULTER XL-I 100 000 rpm T = 4 - 40ºC Detekce→ UV, VL absorpce, interference index lomu  1.Detekce neabsorbujících biomakromolekul (sacharidy) 2.Detekce změn konformace nebo asociace bílkovin vlivem ligandů nebo léčiv 3.Vhodnější pro SV celých buněk – rychlejší akumulace dat

23 4.4.3. ANALYTICKÁ CENTRIFUGA - DETEKCE Šlíry (index lomu) Interference Fotografická absorbance (Schachman 1959) Fotoelektrická absorbance- současný optický systém

24 Kyveta pro AU Dráha – 1,5 cm Obsah 20-200 μl c - 0,1mg/ml

25

26 4.4.4. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE - VYUŽITÍ 1.Stanovení M –Bez kalibrace (x GPC a ElFo) –Široký rozsah: 10 2 (sacharosa, AA) – 10 6 (viry, organely) !!! –Malé množství (20 – 120 μl) i c (0, 01 – 1 g/l), i vysoká c 2.Stanovení homogenity –rychlé, kvantitativní určení distribuce částic, stupeň agregace –volně v roztoku, nativní, bez případné interakce s matricí 3.Analýza asociujících systémů – široký rozsah: –interakcí jak existují v roztoku (makromolekuly s ionty a malými, solvatace, agregace) –M –c –K (10 – 100 M -1 ) 4. Určení pravděpodobného tvaru (koule x cylinder). Detekce konformačních změn ?

27 4.4.5. ANALYTICKÁ ULTRACENTRIFUGACE - ZÁVĚR AU je všestranná, přesná metoda pro studium biomakromolekul v roztoku při vybrané T M a S K asociace Solvatace, agregace Heterogenita roztoku Tvar, změny konformace


Stáhnout ppt "4. CENTRIFUGACE Podmínka dělení: l ≥ 1  suspenze  emulze  koloidní roztoky (NK, bílkoviny)"

Podobné prezentace


Reklamy Google