Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie"— Transkript prezentace:

1

2 Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie

3 Kde najdu informace? Stránky v češtině Přednášky na Jihočeské universitě v Českých BudějovicíchPřednášky na Jihočeské universitě v Českých Budějovicích Enzymologie - Přednášky v PowerPointu, verze 2002 a 1995

4 Enzymologie Nauka o biokatalýze a biokatalyzátorech

5 Enzymologie studium struktury enzymů studium kinetiky enzymových reakcí studium reakčních mechanismů studium forem a lokalizace enzymů studium vztahu enzymů k patologii organismů praktické využití enzymů příprava a studium umělých enzymů

6 Co nás čeká ??? 1. Struktura bílkovin 2. Klasifikace a názvosloví enzymů, charakterizace jednotl. tříd enzymů 3. Koenzymy, jejich klasifikace, charakterizace, modifikace, využití 4. Struktura a funkce enzymů, mechanismy enzymových reakcí 5. Kinetika enzymových reakcí. Kinetika inhibice enzymových reakcí 6. Charakterizaci enzymů (MW, IEP, K M, pH a teplotní optimum Metody pro stanovení enzymových aktivit 8. Inhibitory a aktivátory. Klasifikace, charakterizace, využití 9. Upstream processing 10. Downstream processing 11. Imobilizace a stabilizace enzymů 12. Aplikace enzymů 13. Nejnovější poznatky v enzymologii

7 Katalýza Katalýza - Berzelius 1838 Katalyzátor látky urychlující chemické reakce nemění rovnováhu chemických reakcí snižují aktivační energii

8 Biokatalyzátory globulární bílkoviny RNA - CZECH a ALTMAN (1986) jednoduchá x složená bílkovina více než 3000 enzymů v buňce enzymy jsou druhově specifické velmi účinné (až molekul/s) specifita reakční, substrátová aktivní za mírných podmínek možnost regulace netoxické

9 Historie poznání enzymů 18 století: trávicí účinek žaludeční šťávy 1878: KŰHNE  zavedl název ENZYM (En Zyme - v kvasnicích) BUCHNER - extrakt kvasinek katalyzuje kvašení SUMNER - bílkovinná povaha enzymů - ureasa

10 Enzymové technologie Použití isolovaných enzymů, enzymových komplexů a buněk Isolace enzymů Imobilizace enzymů, enzymových komplexů a buněk Enzymové procesy v nevodných systémech, micelách, dvoufázových systémech

11 Technické enzymy Proteasy (bakteriální) Syřidla Glukoamylasy Alfa-amylasy Glukosaisomerasy

12 Enzymy jsou proteiny Proteiny jsou složeny z 20 kódovaných aminokyselin L-enantiomery

13 Chemická struktura aminokyselin R představuje jeden z 20 různých typů postranních řetězců Hlavní řetězec je neměnný - základ peptidové vazby, existence dvou enantiomerních konfigurací, tvorba vodíkových můstků

14 Hlavní řetězec aminokyselin – vliv pH při fysiologickém pH mají volné aminokyseliny charakter amfiontu (“zwitterion”) pK COOH skupiny je mezi pK NH 2 skupiny je mezi pI = 0.5 (pK 1 + pK 2 ) pH 1pH 7pH 11

15 aminokyseliny - optická aktivita alfa atom uhlíku je asymetrický pro 19 z 20 běžných aminokyselin (výjimkou je glycin, kde R = H). 19 aminokyselin se vyskytuje jako L- isomer. D-aminokyseliny jsou vzácné. L-isomer rovina souměrnosti D-isomer (vzácný) Threonin a isoleucin obsahují dva asymetické atomy uhlíku  existují čtyři stereoisomerní formy

16 Klasifikace aminokyselin podle postranních řetězců hydrofobní hydrofilní - neutrální - kyselé - zásadité

17 6 hydrofilních neutrálních postranních řetězců. Všechny obsahují =O, O-H nebo N-H skupiny které tvoří vodíkové můstky. 2 hydrofilní kyselé postranní řetězce. Obsahují karboxylové skupiny COO - s negativním nábojem při fysiologickém pH. pK 3.9 (aspartát) and 4.3 (glutamát). 3 hydrofilní basické postranní řetězce. Obsahují N-H skupiny (protonované u lysinu a argininu při fysiologickém pH). 9 hydrofobních postranních řetězců. Všechny obsahují zejména C-H vazby které málo interagují s molekulami vody. Jsou většinou uvnitř molekuly proteinu. Přehled aminokyselin

18 Šest hydrofilních neutrálních aminokyselin Serine Threonine Tyrosine Asparagine Glutamine Cysteine Ser, S Thr, T Tyr, Y Asn, N Gln, Q Cys, C Tvoří vodíkové můstky. Obvykle na povrchu proteinů.

19 Dvě kyselé aminokyseliny Tři basické aminokyseliny Aspartate Glutamate Asp, D Glu, E Lysine Arginine Histidine Lys, K Arg, R His, H Tvoří vodíkové můstky. Obsahují ionizovatelné skupiny.

20 Histidin pK cca 6  při fysiologickém pH imidazolový kruh může fungovat jako donor i akceptor protonů Imidazolový kruh zároveň působí jako nukleofil Histidin se vyskytuje v aktivním místě velké řady enzymů

21 Devět hydrofobních aminokyselin Glycine, Gly, G Alanine, Ala, A Valine, Val, V Leucine, Leu, L Isoleucine, Ile, I Methionine, Met, M Phenylalanine, Phe, F Tryptophan, Trp, W Proline, Pro, P (imino kyselina) Netvoří vodíkové můstky Ponořeny v proteinech

22 Tvorba peptidové vazby Peptidová vazba spojuje aminokyseliny  vede ke vzniku proteinů Polypeptidický řetězec vždy začíná na N-konci (aminokyselinový zbytek č. 1; volná NH 3 + skupina je nalevo) a končí na C-konci (volná COO - skupina napravo).

23 Peptidická vazba je rigidní Mezi sousedními postranními řetězci jsou tři vazby. Jedna z vazeb vykazuje částečně násobný charakter a nemůže rotovat - je rigidní. Ostatní dvě vazby mohou rotovat. Tyto skutečnosti umožňují vznik sekundárních struktur (  -helix,  -struktury).

24 Čtyři úrovně struktury bílkovin Primární struktura (chemická): pořadí aminokyselin v řetězci, další detaily (umístění disulfidických můstků, prosthetických skupin, glykosylace). Sekundární struktura: vzájemný prostorový vztah sousedních nebo blízkých aminokyselin. Typické struktury:  -helix,  -struktura. Stabilizace pouze vodíkovými můstky. Terciární struktura: vzájemný prostorový vztah vzdálených částí řetězce. Stabilisace vodíkovými můstky, iontovými interakcemi, hydrofobními interakcemi a disulfidickými můstky. Kvartérní struktura: prostorové uspořádání molekulových podjednotek, které tvoří celistvé molekuly (např: 2  a 2  řetězce hemoglobinu)

25 Bílkoviny:  - helix Vlastnosti: (1) „Tyčkovitý“ tvar, postranní řetězce směřují ven (2) Všechny C=O a N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky jsou rovnoběžné s osou helixu (4) 3.6 aminokyselinového zbytku na jednu otočku (5) Pravotočivý směr díky přítomnosti L-aminokyselin

26 Bílkoviny: α-helix

27 Bílkoviny: β-struktury Maximálně „natažený“ proteinový řetězec. Vlastnosti: (1) Řetězec je natažen, postranní řetězce směřují střídavě nahoru a dolů (2) Všechny C=O & N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky se vytváří mezi jednotlivými řetězci a jsou kolmé na řetězce (4) Paralelní struktury: N-konce jsou na téže straně (5) Antiparalelní struktury: N- konce jsou na opačných stranách

28 Bílkoviny: β-struktury

29

30 Supersekundární struktura

31 Intramolekulární vazby

32 Terciární struktura - myoglobin

33 Kvartérní struktura glutaminsynthetasa 12 podjednotek

34 Aminokyselinové složení proteinů Úplná hydrolýza proteinu (6 M HCl, 110 °C, 20 – 72 hod.) Dělení aminokyselin ionexovou chromatografií HPLC na reverzních fázích Fotometrická detekce po reakci AK s ninhydrinem Automatické analyzátory aminokyselin

35 Počet polypeptidických řetězců Stanovení počtu N- a C- koncových aminokyselin Značení α-amino skupiny (např. 2,4- dinitrofluorbenzenem)  hydrolýza proteinu  detekce značených aminokyselin Odštěpení aminokyselin z C-konce karboxypeptidasou Podmínka: řetězce mají různé koncové aminokyseliny!

36 Určení N-koncové aminokyseliny

37 Přerušení disulfidických můstků Tvořeny cysteinem Uvolnění jednotlivých řetězců Oxidace kyselinou permravenčí na kys. cysteovou

38 Přerušení disulfidických můstků Redukce merkaptoethanolem a následující karboxymethylace kyselinou jodoctovou  karboxymethylcystein

39 Stanovení primární struktury Postupné odbourávání od N-konce Edmanův postup Použití fenylisothiokyanátu Možno analysovat peptidy do aminokyselin

40 Edmanovo odbourávání

41 Štěpení dlouhých řetězců Specifické proteasy (trypsin, chymotrypsin, pepsin, thermolysin...) Chemické štěpení (bromkyan štěpí za methioninem) Následná separace štěpů chromatografickými a elektroforetickými metodami Nutná dvě nezávislá štěpení (metoda překrývajících se štěpů)

42 Kdo byl první??? Ribonukleasa (1960) F. Sanger – Nobelova cena


Stáhnout ppt "Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie"

Podobné prezentace


Reklamy Google