Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie"— Transkript prezentace:

1

2 Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie ivosaf@yahoo.com ivosaf@seznam.cz

3 Kde najdu informace? http://www.usbe.cas.cz/people/safarik/ Stránky v češtině Přednášky na Jihočeské universitě v Českých BudějovicíchPřednášky na Jihočeské universitě v Českých Budějovicích Enzymologie - Přednášky v PowerPointu, verze 2002 a 1995

4 Enzymologie Nauka o biokatalýze a biokatalyzátorech

5 Enzymologie studium struktury enzymů studium kinetiky enzymových reakcí studium reakčních mechanismů studium forem a lokalizace enzymů studium vztahu enzymů k patologii organismů praktické využití enzymů příprava a studium umělých enzymů

6 Co nás čeká ??? 1. Struktura bílkovin 2. Klasifikace a názvosloví enzymů, charakterizace jednotl. tříd enzymů 3. Koenzymy, jejich klasifikace, charakterizace, modifikace, využití 4. Struktura a funkce enzymů, mechanismy enzymových reakcí 5. Kinetika enzymových reakcí. Kinetika inhibice enzymových reakcí 6. Charakterizaci enzymů (MW, IEP, K M, pH a teplotní optimum.... 7. Metody pro stanovení enzymových aktivit 8. Inhibitory a aktivátory. Klasifikace, charakterizace, využití 9. Upstream processing 10. Downstream processing 11. Imobilizace a stabilizace enzymů 12. Aplikace enzymů 13. Nejnovější poznatky v enzymologii

7 Katalýza Katalýza - Berzelius 1838 Katalyzátor látky urychlující chemické reakce nemění rovnováhu chemických reakcí snižují aktivační energii

8 Biokatalyzátory globulární bílkoviny RNA - CZECH a ALTMAN (1986) jednoduchá x složená bílkovina více než 3000 enzymů v buňce enzymy jsou druhově specifické velmi účinné (až 5.10 4 molekul/s) specifita reakční, substrátová aktivní za mírných podmínek možnost regulace netoxické

9 Historie poznání enzymů 18 století: trávicí účinek žaludeční šťávy 1878: KŰHNE  zavedl název ENZYM (En Zyme - v kvasnicích) 1897 - BUCHNER - extrakt kvasinek katalyzuje kvašení 1926 - SUMNER - bílkovinná povaha enzymů - ureasa

10 Enzymové technologie Použití isolovaných enzymů, enzymových komplexů a buněk Isolace enzymů Imobilizace enzymů, enzymových komplexů a buněk Enzymové procesy v nevodných systémech, micelách, dvoufázových systémech

11 Technické enzymy Proteasy (bakteriální) Syřidla Glukoamylasy Alfa-amylasy Glukosaisomerasy

12 Enzymy jsou proteiny Proteiny jsou složeny z 20 kódovaných aminokyselin L-enantiomery

13 Chemická struktura aminokyselin R představuje jeden z 20 různých typů postranních řetězců Hlavní řetězec je neměnný - základ peptidové vazby, existence dvou enantiomerních konfigurací, tvorba vodíkových můstků

14 Hlavní řetězec aminokyselin – vliv pH při fysiologickém pH mají volné aminokyseliny charakter amfiontu (“zwitterion”) pK COOH skupiny je mezi 1.7-2.6 pK NH 2 skupiny je mezi 9.0-10.8 pI = 0.5 (pK 1 + pK 2 ) pH 1pH 7pH 11

15 aminokyseliny - optická aktivita alfa atom uhlíku je asymetrický pro 19 z 20 běžných aminokyselin (výjimkou je glycin, kde R = H). 19 aminokyselin se vyskytuje jako L- isomer. D-aminokyseliny jsou vzácné. L-isomer rovina souměrnosti D-isomer (vzácný) Threonin a isoleucin obsahují dva asymetické atomy uhlíku  existují čtyři stereoisomerní formy

16 Klasifikace aminokyselin podle postranních řetězců hydrofobní hydrofilní - neutrální - kyselé - zásadité

17 6 hydrofilních neutrálních postranních řetězců. Všechny obsahují =O, O-H nebo N-H skupiny které tvoří vodíkové můstky. 2 hydrofilní kyselé postranní řetězce. Obsahují karboxylové skupiny COO - s negativním nábojem při fysiologickém pH. pK 3.9 (aspartát) and 4.3 (glutamát). 3 hydrofilní basické postranní řetězce. Obsahují N-H skupiny (protonované u lysinu a argininu při fysiologickém pH). 9 hydrofobních postranních řetězců. Všechny obsahují zejména C-H vazby které málo interagují s molekulami vody. Jsou většinou uvnitř molekuly proteinu. Přehled aminokyselin

18 Šest hydrofilních neutrálních aminokyselin Serine Threonine Tyrosine Asparagine Glutamine Cysteine Ser, S Thr, T Tyr, Y Asn, N Gln, Q Cys, C Tvoří vodíkové můstky. Obvykle na povrchu proteinů.

19 Dvě kyselé aminokyseliny Tři basické aminokyseliny Aspartate Glutamate Asp, D Glu, E Lysine Arginine Histidine Lys, K Arg, R His, H Tvoří vodíkové můstky. Obsahují ionizovatelné skupiny.

20 Histidin pK cca 6  při fysiologickém pH imidazolový kruh může fungovat jako donor i akceptor protonů Imidazolový kruh zároveň působí jako nukleofil Histidin se vyskytuje v aktivním místě velké řady enzymů

21 Devět hydrofobních aminokyselin Glycine, Gly, G Alanine, Ala, A Valine, Val, V Leucine, Leu, L Isoleucine, Ile, I Methionine, Met, M Phenylalanine, Phe, F Tryptophan, Trp, W Proline, Pro, P (imino kyselina) Netvoří vodíkové můstky Ponořeny v proteinech

22 Tvorba peptidové vazby Peptidová vazba spojuje aminokyseliny  vede ke vzniku proteinů Polypeptidický řetězec vždy začíná na N-konci (aminokyselinový zbytek č. 1; volná NH 3 + skupina je nalevo) a končí na C-konci (volná COO - skupina napravo).

23 Peptidická vazba je rigidní Mezi sousedními postranními řetězci jsou tři vazby. Jedna z vazeb vykazuje částečně násobný charakter a nemůže rotovat - je rigidní. Ostatní dvě vazby mohou rotovat. Tyto skutečnosti umožňují vznik sekundárních struktur (  -helix,  -struktury).

24 Čtyři úrovně struktury bílkovin Primární struktura (chemická): pořadí aminokyselin v řetězci, další detaily (umístění disulfidických můstků, prosthetických skupin, glykosylace). Sekundární struktura: vzájemný prostorový vztah sousedních nebo blízkých aminokyselin. Typické struktury:  -helix,  -struktura. Stabilizace pouze vodíkovými můstky. Terciární struktura: vzájemný prostorový vztah vzdálených částí řetězce. Stabilisace vodíkovými můstky, iontovými interakcemi, hydrofobními interakcemi a disulfidickými můstky. Kvartérní struktura: prostorové uspořádání molekulových podjednotek, které tvoří celistvé molekuly (např: 2  a 2  řetězce hemoglobinu)

25 Bílkoviny:  - helix Vlastnosti: (1) „Tyčkovitý“ tvar, postranní řetězce směřují ven (2) Všechny C=O a N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky jsou rovnoběžné s osou helixu (4) 3.6 aminokyselinového zbytku na jednu otočku (5) Pravotočivý směr díky přítomnosti L-aminokyselin

26 Bílkoviny: α-helix

27 Bílkoviny: β-struktury Maximálně „natažený“ proteinový řetězec. Vlastnosti: (1) Řetězec je natažen, postranní řetězce směřují střídavě nahoru a dolů (2) Všechny C=O & N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky se vytváří mezi jednotlivými řetězci a jsou kolmé na řetězce (4) Paralelní struktury: N-konce jsou na téže straně (5) Antiparalelní struktury: N- konce jsou na opačných stranách

28 Bílkoviny: β-struktury

29

30 Supersekundární struktura

31 Intramolekulární vazby

32 Terciární struktura - myoglobin

33 Kvartérní struktura glutaminsynthetasa 12 podjednotek

34 Aminokyselinové složení proteinů Úplná hydrolýza proteinu (6 M HCl, 110 °C, 20 – 72 hod.) Dělení aminokyselin ionexovou chromatografií HPLC na reverzních fázích Fotometrická detekce po reakci AK s ninhydrinem Automatické analyzátory aminokyselin

35 Počet polypeptidických řetězců Stanovení počtu N- a C- koncových aminokyselin Značení α-amino skupiny (např. 2,4- dinitrofluorbenzenem)  hydrolýza proteinu  detekce značených aminokyselin Odštěpení aminokyselin z C-konce karboxypeptidasou Podmínka: řetězce mají různé koncové aminokyseliny!

36 Určení N-koncové aminokyseliny

37 Přerušení disulfidických můstků Tvořeny cysteinem Uvolnění jednotlivých řetězců Oxidace kyselinou permravenčí na kys. cysteovou

38 Přerušení disulfidických můstků Redukce merkaptoethanolem a následující karboxymethylace kyselinou jodoctovou  karboxymethylcystein

39 Stanovení primární struktury Postupné odbourávání od N-konce Edmanův postup Použití fenylisothiokyanátu Možno analysovat peptidy do 60 - 70 aminokyselin

40 Edmanovo odbourávání

41 Štěpení dlouhých řetězců Specifické proteasy (trypsin, chymotrypsin, pepsin, thermolysin...) Chemické štěpení (bromkyan štěpí za methioninem) Následná separace štěpů chromatografickými a elektroforetickými metodami Nutná dvě nezávislá štěpení (metoda překrývajících se štěpů)

42 Kdo byl první??? Ribonukleasa (1960) F. Sanger – Nobelova cena


Stáhnout ppt "Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie"

Podobné prezentace


Reklamy Google