Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům."— Transkript prezentace:

1 Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům

2 Úvod Etiopatogeneticky je zásadní role při vzniku diabetu 1.typu (T1D) připisována autoreaktivním T lymfocytům (polarizace ve směru Th1).

3 Úvod - pokračování T-lymf  buňka B-lymf Makrofágy, Tc prediabetes záchyt protilátekmanifestace diabetu ICA, GAD65A, IAA, IA2A CYTOKINY t

4

5 Co dělat? Vyléčit – neumíme, léčit – umíme, ALE… Zabránit vzniku – neumíme, ALE… nicméně v každém případě musí být opatření cílená na prevenci realizována nejpozději ve fázi prediabetu…proto také predikce

6 Program predikce diabetu 1.typu Určení (ne)přítomnosti rizikových alel diabetogenních genů (HLA molekuly II.třídy), cca 40%genetické vnímavosti k T1D  určení celoživotního rizika pro vznik T1D Protilátky proti GAD65, IA2  určení středně-krátkodobého rizika pro vznik T1D

7 Kategorie genetického rizika DM 1 u prvostupňových příbuzných českých diabetických dětí Cinek O.

8

9 Co ale ty T lymfocyty?

10 Problém detekce autoreaktivních lymfocytů četnost autoreaktivních T-lymfocytů v periferní krvi buněk / 1 mil

11 The Immunology of Diabetes Society

12 Název projektu: DETEKCE ANTI-INZULÁRNÍ T BUNĚČNÉ ODPOVĚDI U PACIENTŮ S DIABETEM 1.TYPU A U JEJICH PRVOSTUPŇOVÝCH PŘÍBUZNÝCH Číslo projektu: NR Doba řešení: – Poskytovatel: IGA MZ ČR Hlavní řešitel: MUDr.Kateřina Štechová, PhD., Laboratoř autoimunitních onemocnění Pediatrické kliniky UK 2.LF, Praha Spoluřešitel: Doc.MUDr.František Saudek, DrSc., Klinika diabetologie Centra diabetologie IKEM, Praha

13 Anotované cíle projektu Hlavní cíl: Zavést a standardizovat laboratorní metodu umožňující sledovat přítomnost a intenzitu T buněčné odpovědi zaměřené proti nejdůležitějším známým diabetogenním autoantigenům. Cílem bylo zlepšení diagnostiky osob potenciálně ohrožených vznikem diabetu (z okruhu prvostupňových příbuzných pacientů) a zlepšení sledování efektu imunointervenčních postupů. Vedlejší cíl: Ověřit, zda by popsaná metoda byla využitelná i v dalších aplikacích: Sledování průběhu (stavu T buněčné imunity) po transplantaci pankreatu (včetně event. transplantace ostrůvků) V diagnostice autoimunitního procesu u dospělých pacientů s diabetem 1.typu (LADA diabetes) Hypotéza: cytokinová diagnostika umožní zachytit patologickou Th1 odpověď vůči diabetogenním autoantigenům (IFN-gamma x IL-4)

14 2003 Proliferační test aktivace T lymfocytů intracelulární stanovení cytokinů + stanovení povrchových markerů T lymfocytů FACS stanovení aktivačních markerů tetramerová analýza ELISPOT, ELISA

15 Uspořádání studie Čerstvě izol. PBMNC + autoantigeny Inkubace a pak protein micro array analýza cytokinů z kult.supernatantu (+ ELISPOT a ELISA) Reakce? Typ a intenzita. Autoprotilátky, C peptid, HLA typ. Klin.a anamn.data

16 (Auto)antigeny GAD 65 GAD a.a IA-2/R2 a.a Proinsulin, B ř. a.a.9-23 (Hsp277 a.a ) PHA jako pozitivní kontrolaIDS

17 Pos Neg GCSFGM-CSFGROGRO -alfa Pos Neg GCSFGM-CSFGROGRO -alfa IL-1alfaIL-2IL-3IL-5IL-6IL-7IL-8IL-10 IL-1alfaIL-2IL-3IL-5IL-6IL-7IL-8IL-10 IL-13IL-15IFN-gammaMCP-1MCP-2MCP-3MIGRANTES IL-13IL-15IFN-gammaMCP-1MCP-2MCP-3MIGRANTES TGF-beta1TNF-alfaTNF-betablank Pos TGF-beta1TNF-alfaTNF-betablank Pos Také ELISPOT +IL-4 Také ELISA

18 SkupinaPlánovaný počet vyšetření na celou dobu řešení projektu Počet osob, které vstoupily do projektu Finálně statisticky hodnocení recentní záchyt diabetu Příbuzní60207 (rodiče 116, sourozenci 91) 60 bez autoprotil. +10 s protilátkami zdravé kontroly transplantovaní1510 Soubor

19 Vstupní kritéria žádné další přidružené autoimunitní choroby (kromě diabetu) nebo imunopatie náběr mezi 8. a 9. hodinou ráno nepřítomnost jakýchkoliv známek infekčního onemocnění nepřítomnost větší fyzické zátěže 24h před odběrem krve v případě pacientů s čerstvou manifestací diabetu byl náběr proveden 7 dní od stanovení diagnózy za předpokladu normalizace parametrů vnitřního prostředí (ionty, parametry acidobazické rovnováhy) a za předpokladu, že klinik nehodnotil diabetickou ketoacidózu při záchytu choroby jako těžkou (pH≤7,1). U pacientů s diabetem byl náběr proveden při glykémii v rozmezí 4-10 mmol/l.

20 Statistická analýza Jelikož data nevykazovala normální rozložení, byly pro analýzu užity neparametrické metody. V rámci statistického vyhodnocení bylo v první fázi byla ověřována hypotéza, zda existuje vliv příslušnosti vyšetřované osoby k určité skupiny na produkci cytokinů a chemokinů v organismu. Hodnocení bylo provedeno Kruskal Wallisovým testem. Hladina významnosti byla zvolena α=0,05. Pokud byla nalezen statisticky významný rozdíl mezi všemi čtyřmi skupinami, bylo přistoupeno k mnohonásobnému porovnání (jednotlivé skupiny mezi sebou). Mnohonásobné porovnání bylo provedeno Mann – Whitney U testem s následnou korekcí hladiny významnosti – za signifikantní byly považovány hodnoty p<0,05/6, tj. p<0,0083. Pro proměnné, které statisticky významně odlišují porovnávané skupiny, bylo snahou nalézt také hladinu, na které jsou skupiny nejlépe odlišeny. Pro nalezení takového bodu byly použity ROC křivky.

21 Výsledky Produkce cytokinů a chemokinů se mezi sledovanými skupinami lišila a to jak bazální – tak i po specifické stimulaci. Naprosto se svými výsledky vydělila skupina prvostupňových příbuzných s pozitivní alespoň jednou autoprotilátkou, tedy skupina, kterou je z hlediska brzkého vzniku diabetu 1.typu riziková.

22 Cytokin (chemokin) Mann- Whitney U test (exact p-hodnota) SensitivitaSpecificita Plocha pod křivkou P-hodnota pro ROC křivku GCSFp=0,0010,8331,00,944p=0,006 GM-CSFp=0,0010,8890,750,8958p=0,015 IL-1 alfap=0,0030,8331,00,9583p=0,005 IL-2p=0,0030,611,00,8958p=0,015 IL-3p<0,0010,8891,00,972p=0,004 IL-5p<0,0010,7781,00,9514p=0,006 IL-7p=0,0020,8330,750,8819p=0,019 IL-13p<0,0010,9441,00,972p=0,004 MIGp=0,0010,8330,750,889p=0,017 TGF betap=0,0030,6671,00,8403p=0,037 TNF alfap<0,0010,8891,00,9514p=0,006 DRL+vs DV

23 ROC křivka pro IL-5 DV vs DRL+ ROC křivka pro IL-13 DV vs DRL+

24 IL-5 a IL-13 %intenzity p  0,001 p=0,002 p  0,001 (oba) p=0,001 %intenzity

25 IL-5 a IL-13 korelace DDVDRLDRL (HR) IL-5IL-3 (r=0,883), IL-2 (r=0,834) a IL-6 (r=0,803) IL-1alpha (r=0,880) IL-10 (r=0,879), MCP-1 (r=0,846), TNF-alpha (r=0,823) IL-8 (r=0,941) IL-13IL-1alpha (r=0,931), TNF-beta (r=0,873) a IL-7 (r= 0,846)

26 IFN-gamma %intenzity spotu P=0,003 P=0,006

27 Změna reaktivity po specifické stimulaci jednotlivými autoantigeny Po stimulaci směsí diabetogenních autoantigenů byly zjištěny následující statisticky signifikantní rozdíly (pozn.byl použit Wilcoxonův párový neparametrický test, kdy za signifikantní je považováno p  0,05: u pacientů s diabetem byl významný pokles v produkci IL-3 (p=0,008) a IL-15 (p=0,038). U příbuzných bez protilátek byl signifikantní pokles IL-1 (p=0,013) a MCP-2 (p=0,045). U příbuzných s protilátkami byl pozorován signifikantní nárůst produkce IL-6 (p=0,043). Ve skupině zdravých kontrol nebyly pozorovány statisticky signifikantní rozdíly mezi bazální produkcí a produkcí po stimulaci autoantigeny.

28 Odpověď na stimulaci jednotlivými autoantigeny uváděny průměrné hodnoty pro TNF-beta v pg/ml SkupinaNKGAD65-1GAD65-2GAD65-3GAD65IA2 peptidPI peptidSměs auto ag D DV DRL DRL HR

29 Rozdílná reaktivita proti jednotlivým autoantigenům u příbuzného s pozitivními autoprotilátkami stanovená metodou ELISA IFN gamma (pg/ml) TNF beta (pg/ml) IL4 (pg/ml) IL6 (pg/ml) IL10 (pg/ml) bazální produkce produkce stimulovaná směsí autoantigenů GAD GAD HIGH586 GAD Celá molekula GAD proinzulín tyrozinfosfatáza IA HIGH53

30 Závěr – část 1 Pro sledování reaktivity vůči diabetogenním autoantigenům bychom doporučovali na základě našich výsledků vyšetřovat zejména produkci TNF-beta, IL-10 a IL-6 (metodou ELISA resp. ELISPOT). Pro obecné posouzení chování imunitního systému člověka ohroženého vznikem diabetu bychom doporučili například pomocí proteinové microarray doplnit ještě následující panel cytokinů a chemokinů: IL-2, (IFN-gamma), IL-5,-13, TGF-beta1, GCSF, IL-1alpha, TNF-alpha, IL-15, MCP-2 a MIG. Posuzování specifické reaktivity je jednoznačně vhodnější pomocí jednotlivých autoantigenů než pomocí jejich směsi, i když to klade větší nároky na pracnost. Test musí být proveden za jasně specifikovaných podmínek.

31 Srovnání jednotlivých metod cytokinové a chemokinové detekce Největší přednost(i) Největší zápor(y)ProveditelnostDostupnost kitů (v ČR) Proteinová micrroarray Simultánní detekce mnoha parametrů, ideální screeningová metoda U některých látek vyšší detekční limit, metoda není kvantitativní Není obtížná, Pro záznam výsledku nutný scanner nebo digitální fotoaparát a program analýzy obrazu. Dobrá, spektrum nabízejících firem je ale úzké ELISPOTDetekce na úrovni jedné buňky Pracnost, každý cytokin nutno analyzovat zvlášť (s duálními kity nakonec nebyla dobrá zkušenost) Z uvedených metod subjektivně nejpracnější, poněkud problémy s analýzou (nutný alespoň nějaký program analýzy obrazu, ideálně ELISPOT reader, ale je drahý) Špatná, ale dobrá v rámci EU ELISAKvantitativní výsledek v konkrétní koncentraci Každý cytokin nutno analyzovat zvlášť Není obtížná, nutný ELISA reader, ten je ale většinou běžně dostupný Široká nabídka od mnoha firem

32 Další výstupy projektu Reaktivita PBMC na polyklonální aktivátor (PHA) Vliv dalších faktorů na produkci cytokinů a chemokinů posuzovaný pomocí proteinové microarray Pohlaví Genetické riziko Věk Pozitivita autoprotilátek, C peptid, FPIR Denní doba (Ráno vs odpoledne) Pohybová zátěž Vliv stavu metabolismu a glykémie na výsledek Reaktivita čerstvě izolovaných PBMC vs kryoprezervovaných Změna reaktivity v čase Transplantovaní

33 Děkuji za pozornost


Stáhnout ppt "Predikce diabetu 1.typu a výsledky studie mapující buněčnou reaktivitu proti diabetogenním autoantigenům."

Podobné prezentace


Reklamy Google