Radioimunoesej, enzymoimunoesej – princip, využití

Prezentace na téma: "Radioimunoesej, enzymoimunoesej – princip, využití"— Transkript prezentace:

1 Radioimunoesej, enzymoimunoesej – princip, využití
Laboratorní stanovení specifických IgE protilátek Laboratorní stanovení autoprotilátek Průtoková cytometrie – princip, využití Laboratorní metody vyšetřování buněčné imunity Laboratorní metody vyšetřování humorální imunity

2 Stanovení humorálních analytů
Precipitace Aglutinace Turbidimetrie Nefelometrie

3 Imunoprecipitace Srážení - proces, při němž dochází interakcí antigenu a protilátky ke vzniku (imuno)precipitátu. Vzhledem k tomu, že protilátky mají v molekule nejméně dvě identická vazebná centra pro daný antigen, mohou při vhodném koncentračním poměru obou partnerů vznikat polymerní, nerozpustné a snadno detekovatelné komplexy. Tohoto principu využívá celá řada imunochemických metod ke kvalitativnímu i kvantitativnímu stanovení antigenů nebo jim příslušných protilátek.

4 - vznik nerozpustného precipitátu při reakci ekvivalentních koncentrací rozpustného antigenu s rozpustnou protilátkou (tj. vzniká zesíťovaná struktura mnoha navzájem vázaných antigenů a protilátek, která již v roztoku není rozpustná)

5 Aglutinace Shlukování korpuskulárních částic s povrchovými antigenními strukturami v důsledku interakce se specifickou protilátkou. Antigenem jsou zde obyčejně buňky (bakterie, erytrocyty) nebo syntetické částice (např. latexové) s adsorbovanými antigeny. Tyto částice se působením protilátek shlukují a charakteristickým způsobem sedimentují; na základě vzniku zákalu lze takto stanovit i velmi nízké koncentrace protilátek (kolem 10 ng/ml). Na stejném principu fungují i citlivé testy pro stanovení antigenů.

6

7

8 Imunofixace vzorku séra zdravé osoby
Legenda: sloupec 1: elektroforéza séra další sloupce: imunochemický průkaz jednotlivých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů, je zřetelná polyklonální produkce

9

10 Stanovení humorálních analytů
Precipitace Aglutinace Turbidimetrie Nefelometrie

11

12

13

14 ELISA – průkaz specifických
protilátek Převzato - Krejsek

15 Základní složky ELISA testu
Antigen detekovaný v testovaném vzorku známý, komerčně připravovaný Protilátka detekovaná v testovaném séru známá, komerčně připravovaná Konjugát jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu (IgG, IgM, IgA, IgE), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem) Substrát je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu

16 RAST

17 ELISA – průkaz antigenu
Převzato - Krejsek

18 Klasická 96-jamková destička pro metodu ELISA

19 Nepřímá imunofluorescence
Převzato - Krejsek

20 Stanovení parametrů buněčné imunity
Počty buněk – subpopulace Testy fagocytózy Testy aktivace lymfocytů

21 fluorochrom je konjugován s primární protilátkou
- analýza plné krve - průtoková cytometrie Převzato - Krejsek

22 Průtoková cytometrie

23

24 http://probes. invitrogen

25 „Gatování“ lymfocytů pomocí
FS a SS

26 Stanovení celkových a pomocných
T lymfocytů

27 Stanovení T a B lymfocytů

28 Stanovení aktivovaných lymfocytů (aktivační marker HLA-DR)

29 KLINICKY VÝZNAMNÉ POPULACE LEUKOCYTŮ
CD3+ T lymfocyty: populace zralých T lymfocytů % CD4+ T lymfocyty: subpopulace pomocných induktorových T lymfocytů % CD8+ T lymfocyty: subpopulace tlumivých cytotoxických T lymfocytů % CD25+ T lymfocyty: aktivované T lymfocyty % CD19+ B lymfocyty: populace zralých B lymfocytů % CD56+ NK buňky: přirozeně zabíječské buňky % CD14+ buňky: monocyty CD15+ buňky: granulocyty CD38+ buňky: plazmatické buňky

30 FUNKČNÍ TESTY TESTOVÁNÍ FUNKCÍ T LYMFOCYTŮ IN VITRO je založeno na testování: schopnosti T lymfocytů proliferovat schopnosti T lymfocytů produkovat cytokiny PROLIFERACE T LYMFOCYTŮ: in vitro kultivace kultivační media (thymové působky) CO2 atmosféra

31 HODNOCENÍ FAGOCYTÁRNÍCH FUNKCÍ
absolutní počet granulocytů je pro funkci fagocytózy kritický k testování fagocytózy se používají izolované granulocyty populace granulocytů je mimořádně citlivá na poškození nově lze hodnotit počty a funkce fagocytujících buněk průtokovou cytometrií

32 Přednášky k tématům laboratorní diagnostika AUTOPROTILÁTEK a vyšetření BUNĚČNÉ IMUNITY najdete i na webu LF HK

33

34 ENA pokrač.

35

36