Biochemie v letním semestru - MODUL A - Zápočet 4 praktika (A1 – A4) 3 ústní přezkoušení: Dýchání, Krev a tělní tekutiny Urogenitální systém, Acidobazická rovnováha Trávení a vstřebávání, Intermediární metabolismus

zápočtové přezkoušení: 18.3. / 9:00 LS Modul A / 1. ročník týden Přednáška Praktika (P) / seminář (S) 1 1) Transport kyslíku a oxidu uhličitého / F. Duška Úvod k praktickým cvičením (teorie: odběr kapilární krve, elfo, centrifugace, příprava na BCH praktika) (S) 2 2) Biochemie krevních elementů / V. Kvasnicová Elektroforéza proteinů krevního séra (S/P) A1 3 3) Biochemické aspekty funkce ledvin / F. Duška Struktura, funkce a metabolismus hemoglobinu (S) 4 KONFERENCE dýchání, krev, tělní tekutiny zápočtové přezkoušení: 18.3. / 9:00 5 4) Metabolismus vody a minerálních látek / F. Duška   6 5) Acidobazická rovnováha / F. Duška 6) Funkční BCH trávicího traktu / F. Duška Chem. vyšetření moči, moč. sediment (P) A2 7 ABR, interpretace vyšetření dle Astrupa (S) 8 7) Energetický metabolismus / F. Duška Vyšetření glykemie. Interpretace oGTT (P) A3 9 KONFERENCE urogen. sys./ABR zápočtové přezkoušení: 22. a 23.4 / 8:00 10 8) Obecná toxikologie / P. Tůma 9) BCH jaterní buňky / J. Trnka Stanovení alkalické fosfatázy v séru (P) A4 11 10) Biotransformace xenobiotik / E. Samcová Biochemie jaterní buňky (S) 12 11) Úloha vitamínů v metabolismu / J. Trnka Biotransformace xenobiotik (S) 13 12) Volné radikály a antioxidanty / J. Trnka Vztahy v intermediárním metabolismu (S) 14 KONFERENCE trávení a vstřebávání zápočtové přezkoušení: 25.5. / 9:00 15

Laboratorní metody - letní semestr - Vladimíra Kvasnicová

Preanalytická fáze = příprava a zpracování vzorků před vlastní laboratorní analýzou náběr krve sérum x plazma každý biologický materiál je potenciálně infekční ! ukázka zpracování vzorků krve v biochemické laboratoři - video

Centrifugace = metoda používaná k oddělení pevných složek směsi od přítomné kapalné fáze na základě jejich velikosti, tvaru a hustoty, viskozity média a rychlosti rotoru odstředivá síla: P = m x r x 2 m – hmotnost částice r - poloměr centrifugy  - úhlová rychlost

Centrifugace fixní úhel rotoru nebo horizontální centrifuga musí být vyvážená Obrázek převzat z http://www.all-science-fair-projects.com/science_fair_projects_encyclopedia/Centrifuge a http://www.flickr.com/photos/gonzales2010/9624402/ (únor 2008)

Centrifugace Obrázek převzat z http://www.flickr.com/photos/businesscheese/1803417133/ (únor 2008)

Centrifugace rychlost: počet otáček za minutu (RPM = revolutions per minute) ! Nastavením stejné hodnoty RPM v centrifugách o různém poloměru nedosáhneme stejné odstředivé síly ! odstředivá síla: relativní odstředivé zrychlení (RCF = relative centrifugal force) RCF = 1.12 x 10-5 x r x (rpm)2 r = poloměr centrifugy (cm) jednotky: g RCF udává kolikrát je zrychlení centrifugy větší než je normální tíhové zrychlení g = 9.81 m x s-2

Centrifugace a) běžné laboratorní centrifugy (až 10 000 G) b) vysokorychlostní chlazené centrifugy (až 50 000 G) c) ultracentrifugy /chlazené + vakuum/ (až 500 000 G) příklad: k oddělení séra ze sražené krve stačí centrifugace 10 min. při RCF = 1000 g

Obrázek převzat z http://www. chem. arizona Obrázek převzat z http://www.chem.arizona.edu/tpp/chemt/CAn/Graphics/centrifuge/blood%20centrifugation.png a http://www.academic.marist.edu/~jzmz/HematologyI/Intro3.html (únor 2008)

Obrázek převzat z http://science. tjc Obrázek převzat z http://science.tjc.edu/Course/BIOLOGY/bott/anatomy/2402/summer%202402%20%20blood%20notes/c18_02.jpg a http://faculty.washington.edu/kepeter/119/images/hematocrit_tube_trio.jpg (únor 2008)

A) Preparativní centrifugace slouží k separaci částic od kapalné fáze získáme 2 frakce: sediment (pelleta, pevná fáze) supernatant (kapalná fáze) Obrázek převzat z http://www.steve.gb.com/science/molecular_biology_methods.html (únor 2008)

opakováním postupu získáme frakce různých buněčných organel frakční centrifugace (= diferenciální centrifugace) zvláštní typ preparativní centrifugace používá se k separaci buněčných organel, které se liší velikostí a hustotou při použití nízkého RCF sedimentují jen částice s velkou hustotou → vytvořený supernatant se přelije do jiné zkumavky a centrifuguje při vyšší hodnotě RCF opakováním postupu získáme frakce různých buněčných organel

Frakční centrifugace Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/c7x3fractionation.jpg (únor 2008)

B) Analytická centrifugace používá se k měření fyzikálních vlastností sedimentujících částic (sedimentační koeficient, molekulová hmotnost) používají se ultracentrifugy centrifugované částice jsou během centrifugace sledovány optickým systémem (měření absorbance či zákalu) a průběh procesu je zobrazován pomocí PC

Elektroforéza (ELFO) = analytická metoda založená na pohybu nabitých částic vlivem vnějšího elektrického pole (stejnosměrný proud) rychlost elektromigrace závisí na: a) velikosti, tvaru a náboji částice b) vloženém napětí

Elektroforéza anion – negativně nabitý ion, pohybuje se směrem k anodě (+) kation – pozitivně nabitý ion, pohybuje se směrem ke katodě (-) amfolyt – látka, která může mít pozitivní, negativní či nulový celkový náboj, a to v závislosti na vnějších podmínkách (pH) např. proteiny

Klasifikace elektroforetických technik volná elektroforéza separace probíhá pouze v kapalné fázi (v pufru), tj. bez účasti nosného média (kapilární elektroforéza) elektroforéza na nosičích papír, gel (agaróza, polyakrylamid) horizontální nebo vertikální uspořádání

Kapilární elektroforéza Obrázek převzat z http://www.hood.edu/images/content/academics/instruments/Agilent_Capillary_Electrophoresis_System.JPG (únor 2008)

Kapilární elektroforéza Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Capillary_electrophoresis (únor 2008)

Gelová elektroforéza - horizontální uspořádání Obrázek převzat z http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4.jpg (únor 2008)

Gelová elektroforéza – vertikální uspořádání SDS-PAGE – animace Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/protein/page.jpg (únor 2008)

Parametry ovlivňující elektroforetickou separaci pH mění náboj analytu (disociace) a tím i jeho pohyblivost; může měnit i strukturu analytu (denaturace) iontová síla mění napětí či proud: zvýšení iontové síly obvykle sníží migrační rychlost a způsobí zahřívání systému teplota: vysoká teplota může denaturovat (vysrážet) proteiny; nízká teplota snižuje difuzi, ale také migrační rychlost, nemá vliv na rozlišení proud: příliš vysoký proud způsobí přehřátí systému napětí: migrační rychlost je přímo úměrná napětí čas: rozlišení (vzájemné oddělení proužků) roste lineárně s časem, ale rozmytí proužků (difuze) roste se čtvercem času nosné médium: velikost pórů nosiče a endoosmóza ovlivňují migrační rychlost (výběr typu nosiče)

Průběh elektroforézy aplikace vzorku nastavení vhodného napětí nebo proudu ! STEJNOSMĚRNÝ PROUD ! (gelová elektroforéza: kolem 70 - 100 V, kapilární elektroforéza: kolem 20 000 V) nastavení doby separace: řádově minuty (př. gelová elfo proteinů séra trvá asi 30 min.) při elfo na nosičích následuje po separaci fixace a barvení vyhodnocení: kvalitativní (srovnání se standardy) kvantitativní (na nosičích: densitometricky)

Vybavení pro gelovou elektroforézu používanou v praktiku A1 zdroj stejnosměrného proudu nádobky na barvení a odbarvování gelu elektroforetická komora aplikátor

Elektroforéza – příklady klinického využití - separace proteinů séra, izoenzymů, nukleových kyselin imunoelektroforéza (imunoglobuliny) Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/images/controlGel1.jpg (únor 2008)

Elektroforéza – příklady klinického využití - separace proteinů séra, izoenzymů, nukleových kyselin imunoelektroforéza (imunoglobuliny) Obrázek převzat z http://www.sebia.com/V2/php/index.php?tpc=1&nv=0,2&page=contenu&id_prod=39# (únor 2008)

Využití elektroforézy proteinů k diagnostice nemocí rozdělení proteinů do frakcí je za fyziologických podmínek konstantní (poloha, intenzita) zastoupení proteinů v plazmě se při různých onemocněních mění (vzájemný poměr) specifický vzhled elektroferogramu (rozložení frakcí nebo píků)

Hlavní proteiny jednotlivých frakcí imunoglobuliny: IgG, IgA, IgM 2-makroglobulin haptoglobin 1-antitrypsin orozomukoid transferin C3-komplement

Výsledek ELFO proteinů séra na agarózovém gelu – 6 frakcí hypergama- globulinémie normální nález Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/proteinControl.html (únor 2007)

Výsledek ELFO proteinů séra na agarózovém gelu – 5 frakcí fyziologický nález akutní onemocnění výskyt paraproteinu frakce fibrinogenu při analýze plazmy

Denzitometrický záznam elektroforézy 60% 3% 9% 12% 16% Obrázky převzaty z http://www.sebia-usa.com/products/hyrys2.html a z http://erl.pathology.iupui.edu/LABMED/GENER27.HTM (únor 2007)

Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M. (editor): Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 4th ed. Wiley‑Liss, Inc., New York, 1997. ISBN 0‑471‑15451‑2

Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M Obrázek je převzat z učebnice: Devlin, T. M. (editor): Textbook of Biochemistry with Clinical Correlations, 4th ed. Wiley‑Liss, Inc., New York, 1997. ISBN 0‑471‑15451‑2

Obrázek převzat z http://www. sebia-usa. com/products/reagents Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html (únor 2007)

Obrázek převzat z http://www. sebia-usa. com/products/reagents Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html (únor 2007)

IMUNOFIXACE - určování typu paraproteinu (monoklonálního Ig) Obrázek převzat z http://www.sebia-usa.com/products/reagents.html (únor 2007)

Detekované paraproteiny (monoklonální protilátky /myelom ) Obrázek převzat z http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/B/Blood.html#lipids (duben 2007)