V praktiku budou řešeny dvě úlohy:

Prezentace na téma: "V praktiku budou řešeny dvě úlohy:"— Transkript prezentace:

1 IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Michael Jelínek, Jan Šrámek Lenka Rossmeislová

2 V praktiku budou řešeny dvě úlohy:
1) Detekce proteinů a DNA v rakovinných buňkách - fluorescenční barvení 2) Detekce proteinů po izolaci a následné separaci pomocí SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

3 Úloha 1: Fluorescenční barvení mikrofilament a DNA
aktin: faloidin konjugovaný s fluoroforem TRITC - červený signál DNA: DAPI - modrý signál použité buňky - buněčná linie MCF-7 (rakovinné buňky nádoru prsu) Použité cytostatikum - taxan paclitaxel

4 Fluorescenční barvení - princip
fluorofor Signál produkující molekula → zviditelnění detekované molekuly interagující s detekovanou molekulou Molekula specificky Detekovaná molekula ve vzorku „neviditelné“

5 Fluorescenční barvení - detekce mikrofilament
Faloidin jed z houby Amanita phalloides specificky se váže na mikrofilamenta (tzv. F-aktin) a zabraňuje jejich depolymerizaci (mechanismus toxicity) fluorofor TRITC vyzařuje červené světlo po excitaci zeleným světlem

6 METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce mikrofilament
TRITC → zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu phalloidin F-aktin ve vzorku „neviditelné“

7 Fluorescenční barvení - detekce DNA
DAPI interkaluje se do malého žlábku dsDNA, tato vazba zvyšuje excitační vlastnosti DAPI po excitaci UV světlem vyzařuje modré světlo, volný DAPI svítí mnohem méně - není potřeba promývat

8 Fluorescenční barvení - detekce DNA
DAPI UV DNA → zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu DAPI DNA ve vzorku „neviditelné“

9 Fixace - první krok přípravy vzorku
brání rozkladu a autolýze tkáně cíl  zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín) vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet

10 Pracovní postup: fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS inkubace buněk s konjugátem faloidinu-TRITC odstranění nevázaného faloidinu-TRITC pomocí opakovaného promytí v PBS barvení DNA pomocí DAPI pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

11 Fluorescenční barvení mikrofilament
Kontraktilní prstenec

12 Fluorescenční barvení mikrofilament a DNA
Jak se liší mikrofilamenta a jádra v rostoucích a nerostoucích buňkách?

13 Úloha 2: Detekce proteinů po izolaci a následné separaci pomocí SDS-PAGE - dnes I. část Vzorky: kuřecí sval, roztok BSA, mléko Izolace proteinů z tkáně: prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk Chemicky (používáme v našem experimentu) mechanicky ultrazvuk

14

15 Pracovní postup: Izolace proteinů Stanovení koncentrace proteinů
přenos tkání a poteinů do zkumavky dezintegrace buněk a resuspendování proteinů pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát) oddělení směsi proteinů od nezlyzovaných zbytků centrifugací Stanovení koncentrace proteinů pomocí metody podle Bradfordové použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu pro vytvoření kalibrační křivky

16 Princip metody Bradfordové
kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordové činidla s roztokem obsahujícím proteiny Bradfordové činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (ARG, PHE, TRY a PRO) po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou detekce při 595 nm

17 Kalibrační křivka

18 Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE
Příště uvidíte... Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícím SDS nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinů na polyakrylamidový gel separace proteinů pomocí elektroforézy Identifikace proteinů barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku Coomassie Brilliant blue lokalizace proteinů v gelu, porovnání hladiny proteinů v jednotlivých vzorcích