Enzymová aktivita Kinetika podle Michaelise a Mentenové E + SESE + P Jednotky enzymové aktivity KATAL (kat) 1 katal = 1 mol přeměnéného substrátu (event.

Prezentace na téma: "Enzymová aktivita Kinetika podle Michaelise a Mentenové E + SESE + P Jednotky enzymové aktivity KATAL (kat) 1 katal = 1 mol přeměnéného substrátu (event."— Transkript prezentace:

1 Enzymová aktivita Kinetika podle Michaelise a Mentenové E + SESE + P Jednotky enzymové aktivity KATAL (kat) 1 katal = 1 mol přeměnéného substrátu (event. vzniklého produktu) / s MEZINÁRODNÍ JEDNOTKA (IU, international unit) 1 IU = 1  mol přeměněného substrátu (event. vzniklého produktu) Enzymová aktivita se obvykle stanovuje za optimálních podmínek (teplota, pH, atd.) při nasycení enzymu substrátem (S  Km). Za takovýchto podmínek odpovídá aktivita limitní rychlosti (a = Vlim) V lim Specifická aktivita Aktivita vztažená na jednotkovou hmotnost proteinu (typicky 1 mg) Používá se k charakterizaci čistoty enzymového preparátu

2 Metody homogenizace pletiv Mixer + velké množství zpracovaného materiálu - málo citlivá metodika Ultraturax + rychlé zpracování velkého množství vzorků, snadné chlazení Třecí miska + nejdostupnější metoda homogenizace + vhodná pro velké množství typů homogenizovaných materiálů + lze použít kapalní dusík pro zvýšení efektivity homogenizace - pomalé a fyzicky náročné zpracování vzorku Ultrazvuk + rychlé zpracování velkého množství vzorků, snadné chlazení - možnost vzniku artefaktů díky mechanickému poškození molekul Enzymová lýze + osmotický šok + velmi citlivá metodika - časově náročné, mohou vznikat artefakty Pro každou aplikaci je třeba vybrat vhodnou metodiku v závislosti na vlastnostech izolovaných objektů či látek Pístový homogenizátor + velmi citlivá metoda - obtížne zpracování velkého množství vzorků Balotina + velmi citlivá metoda homogenizace mikroorganizmů - časově náročná metodika Mrazový lis + zpracování velkého množství mikrobiální biomasy - časově náročná metodika

3 Extrakční pufr Pro každou aplikaci je třeba vybrat vhodný pufr v závislosti na vlastnostech izolovaných objektů či látek Osmotikum Vyrovnání osmotického tlaku při izolaci organel sacharosa, manitol Extrakční pufr Pufrační systém Nastavení a stabilitace vhodného pH Tris, fosfát, fyziologické pufry (PIPES, MES, atd.) Adsorpční činidla Odtranění produktů degradace polyfenolů a barviv PVP (polyvynylpyrrolidon) Antioxidanty Ochrana před nežádoucím působením oxidantů (aktivní kyslík atd.) DTT (dithiotreitol), merkaptoethanol Inhibitory proteas Ochrana extrahovaných proteinů před nežádoucí degradací PMSF (fenylmethyl sulfonyflfluorid), EDTA, leupeptin, komerční koktejly inhibitorů Anorganické ionty Stability některých látek nebo enzymů je závislá na přítomnosti určitých anoganických iontů Ca 2+, K +, Mg 2+

4 centrifugace supernatant pelet úhlový rotorkřížový rotor Přetížení (Relative Centrifugation Force ) otáčky (Rounds Per Minute) Hrubě přefiltrovaný extrakt 200  g 1000  g 10 000  g 100 000  g jádra chloroplasty mitochondrie ribosomy Centrifugace

5 Stanovení enzymové aktivity Pro účely stanovení enzymu se obvykle sleduje přírustek koncentrace produktu enzymové reakce v čase. Stanovení se obvykle provádí za optimálních podmínek (teplota, pH, iontová síla) při nasycení enzymu substrátem. Obecné schéma stanovení enzymové aktivity Enzym katalyzující preanalytickou reakci ProduktSubstrát2 Stanovovaný enzym Analytická reakce Detekční reakce Detekovatelný produkt Preanalytická reakce Enzym katalyzující detekční reakci Substrát1 titrační stanovení fotometrie fluorimetrie elektroanalytické metody hmotnostní spektroskopie automatizace stanovení fluoresceindiacetát Esterasa Analytická reakce fluorescein (fluorimetrie)

6 Základní stav Excitace Emise Excitovaný stav Nezářivý přechod Fluorescence (FRU) emmision (nm) excitation (nm) a b Fluorescence fluorescein

7 Zdroj světla Monochromátor Štěrbina Kyveta se vzorkem Monochromátor Štěrbina Fotonásobič Fluorimetrie Schema fluorimetru Pro zředěné roztoky (absorbance < 0,05) platí: Fluorescence = k  koncentrace Kde k je konstanta pro daný fluorimetr. Fluorescence závisí na: teplotě a polaritě prostředí Fluorimetrické měření ruší: zákal přítomnost silně absorbujících látek detergenty