Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová

Prezentace na téma: "Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová"— Transkript prezentace:

1 Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová
DNA izolace Marie Černá, Markéta Čimburová, Marianna Romžová

2 DNA izolace Základní kroky
Lýze buněk Odstranění proteinů - proteáza - adsorpce nebo extrakce Precipitace DNA etanolem Rozpuštění DNA ve vodě či v pufru

3 DNA izolace Tři základní metody
Extrakce fenol-chloroform (rozdílná rozpustnost v roztocích) Vysolovací metoda (precipitace proteinů pomocí NaCl) Adsorpční metoda (silikagelová membrána)

4 Čistota a koncentrace DNA
Spektrofotometrie Absorbční maximum pro nukleové kyseliny 260 nm pro proteiny 280 nm Koncentrace DNA – při 260 nm Čistota DNA: poměr 260/280 nm

5 Čistota a koncentrace DNA
Fluorescentní barvy DNA s navázanými barvami se v gelu zviditelní (etidium bromid) Gel obsahuje DNA standardu (jejíž koncentrace je předem stanovena) Porovnání dvou světelných intensit – standardy a našeho vzorku

6

7 Gelová elektroforéza Separační metoda
Gel – síťovitá struktura polymerních molekul s póry Gel - agaróza - polyakrylamid Etidium bromid je barva vázající se do DNA Vytváří komplex excitující fotony po expozici UV

8 Gelová elektroforéza Separační metoda
PRINCIP: pohyb nabitých molekul v elektrickém poli pohyb ve směru od – k + (nukleové kyseliny obsahují negativně nabité fosfátové skupiny) Rychlost pohybu DNA závisí na délce DNA fragmentu nepřímo úměrně Délka neznámých fragmentů se porovnává s délkou standardních fragmentů