Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba,

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba,"— Transkript prezentace:

1 Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba, L. Benešová Laboratoř molekulární genetiky a onkologie Genomac International

2 Capillary Electrophoresis 1981 Jim Jorgenson - capillary zone electrophoresis (CZE) 1990 Beckman Instruments - first CE system with fluorescence detection 1996 Molecular Dynamics - first commercial capillary array system (CAE) 1998 Celera Genomics (Craig Venter) - high throughput sequencing by CAE 2000 Human Genome Project + Celera Genomics - draft genome sequence

3 Princip formování heteroduplexů (většinou součástí PCR programu) + + Denaturace 95°C 5min Zchlazení Heteroduplexy HomoduplexyssDNAWtMt

4 Princip separace (CE separace za podmínek částečné denaturace) Teplota

5 Denaturant Gradient Gel electrophoresis (DGGE) Fischer, S.G. and L.S. Lerman, Proc Natl Acad Sci, 1983, 80,

6 Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) Heteroduplexes Homoduplexes Riesner et al. Electrophoresis, 1989, 10,

7 Denaturing Capillary Electrophoresis MUT-HET MUT-HOMO WT Time (min) LIF (488 nm / 520 nm) Khrapko et al. Nucleic Acids Res 1994, 22,

8 Denaturing Capillary Electrophoresis standard primer Genomic DNA 200 bp product (labelled) primer with GC-clamp

9 HET1-HET2 WT-HET2 WT-HET1 HOMO2 HOMO1 WT LIF (488 nm / 520 nm) Time (min) Profil 2 mutací v exonu 8 genu TP53

10 Teplotní závislost Time Temperature increase

11 VZOREK Izolace DNA PCR amplifikace a tvorba heteroduplexů TGCE Vyhodnocení Průběh vyšetření Výběr SNP nebo bodové mutace Vyhledání v databázi Tm Optimalizace CE-gradientu Potvrzení mutací sekvenováním Navržení primerů Optimalizace PCR

12 Metodika (CE separace za podmínek částečné denaturace) DNA izolace CE analýza Vzorek PCR amplifikace Vyhodnocení

13 „Mutační spektrometrie“ Vysoké rozlišení Specifické profily, charakteristické polohy píků

14

15 Vysoká citlivost Citlivost mutační detekce (<10% mutované DNA) mutant > 20% mutant < 10 % (mutační spektrometrie )

16 Aplikace

17 Prediktivní genetická diagnostika Testování výskytu mutací Faktor V Leiden Faktor II prothrombin MTHFR CFTR Hemochromatóza Hypercholesterolémie Fenylketonurie FVL

18 Onkologická diagnostika Testování somatických mutací KRAS2 TP53 APC EGFR CDKN (p16 INK4A ) BRCA1 BRCA minutes T  A + C  T 6040 minutes 1450 C  T APC

19 Farmakogenomika Genotypizace SNP pro predikci léčebné odpovědi/toxicity ERCC1 (C118T) ERCC2 (G312A) MDR1 (C3435T) CCND1 (A870G) CYP17A1 CYP3A4

20 Diagnostika predispozice nádorů Genotypizace SNP v predispozici výskytu nádorů CCND1 (A870G) SRD5A2

21 Diagnostické kity ABI PRISM® 310 ABI PRISM® 3100 Avant ABI PRISM® 3100 ABI PRISM® 3130 Beckman CEQ™ 8000 MegaBACE™ 500 MegaBACE™ 1000 Agilent Bioanalyzer 2100

22 Shrnutí Jednoduchý jednostupňový postup Specificita (mutační spektrometrie) Citlivost při detekci somatických mutací Bez nutnosti pořizování nákladné instrumentace Vysoká kapacita (multikapilární přístroje) Nízké náklady

23 Poděkování Laboratoř molekulární genetiky a onkologie, Genomac International, s.r.o. Patrik SekerkaIng. Michala Hrabíková Ing. Radka SlováčkováKateřina Kramperová Barbora BelšánováAndrea Krajčová MUDr. Cyril ŠálekLucie Kašperová Podporováno projektem Ministerstva Průmyslu a Obchodu č. FI-IM3/215

24 Děkuji Vám za pozornost Bavorská 856 Praha 5


Stáhnout ppt "Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba,"

Podobné prezentace


Reklamy Google