Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Molekulární diagnostika septických stavů Miloš Dendis.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Molekulární diagnostika septických stavů Miloš Dendis."— Transkript prezentace:

1 Molekulární diagnostika septických stavů Miloš Dendis

2 Molekulární diagnostika septických stavů je bezesporu největší výzvou rutinní molekulární diagnostiky dneška Molekulární diagnostika septických stavů

3 Vysoká mortalita Molekulární diagnostika septických stavů Incidence (EU) 90,4 případů / obyvatel Mortalita (JIP) 27% (sepse) – 54% (septický šok) Náklady na léčbu 7,6 mld EUR/rok

4 Identifikace SEPSE Molekulární diagnostika septických stavů SIRS (systemic inflamantory response syndrome)  teplota 38°C  HR >90/min.  tachypnea >90/min nebo PaCO2 < 4,3 kPa  WBC 12000b/ul anebo 10% nezralých forem SEPSE  příznaky SIRS + průkaz pathogena Senzitivní a spolehlivý průkaz kauzálního mikroorganismu je klíčový v rozlišení neinfekčního SIRS a infekční SEPSE

5 Rychlost Molekulární diagnostika septických stavů S každou následující hodinou neléčené sepse vzrůstá mortalita o 8% Rychlá identifikace původce sepse vede k nasazení cílené terapie, signifikantně snižuje mortalitu, dobu hospitalizace a celkové náklady na léčbu

6 Hemokultivace Molekulární diagnostika septických stavů  Jako zlatý standard hraje ústřední roli v identifikaci pathogenemie u pacientů s příznaky SIRS a tím v identifikaci SEPSE  Vysoká analytická sensitivita  Časová náročnost (dny)  Nižší spolehlivost - falešně negativní výsledky způsobené předchozím nasazením ATB, nutričními nároky mikroba a jeho viabilitou

7 Kultivačně nezávislé metody Molekulární diagnostika septických stavů  Rychlost (hodiny)  Vyšší spolehlivost - nezávislost na viabilitě detekovaného mikroorganismu, jeho nutričních nárocích a délce životního cyklu  Správná indikace  Správný odběr a jeho načasování  Metodická nejednotnost a pracnost  Nízká analytická sensitivita  Časté kontaminace  Problematická interpretace

8 Komerční výrobci Molekulární diagnostika septických stavů SeptiFast multiplex real-time PCR 25 nejč. původců SepsiTest™ universal real-time PCR + sequencing jakýkoliv Magicplex™ multiplex real-time PCR 27 nejč. původců + 3 rezistence hybcell Bacteria DNA xA hybcell Fungi DNA xA universal PCR + compact sequencing jakýkoliv

9 Indikace k vyšetření a správný odběr Molekulární diagnostika septických stavů  Pro detekci patogenu v krvi je bezpodmínečně nutný fakt, že patogen musí být v odebrané krvi přítomen  Bakteriémie je dynamický proces a bakterie jsou do krevního řečiště uvolňovány v časových intervalech, s různě dlouhými klidovými obdobími  Hlavní roli zde má načasování odběru krve Molekulárně diagnostické metody by měly kopírovat mikrobiologická schémata indikace a odběru vzorků

10 Indikace k vyšetření Molekulární diagnostika septických stavů Nízká pravděpodobnost bakteriemie  ambulantní pacienti, cellulitis, community-acquired pneumonia and community-acquired fever. Střední pravděpodobnost bakteriemie  pyelonephritis Vysoká pravděpodobnost bakteriemie  sepse, septický šok, akutní bakteriální meningitida Pro indikaci vyšetření by mělo být bráno v ohledu především splnění kritérií SIRS. Pouhá horečka anebo leukocytóza nejsou indikací pro výtěžnou hemokulturu. Coburn B, Morris AM, Tomlinson G, Detsky AS. Does this adult patient with suspected bacteremia require blood cultures? JAMA 2012;308:502–11.

11 Správný odběr a jeho načasování Molekulární diagnostika septických stavů SchémaPočet odběrůDoba odběrů I 1.vzestup tělesné teploty 2.hodina po prvním 3.hodina před vrcholem teplotní křivky II 1. v rozmezí 1 hodiny před začátkem terapie 2. 3.těsně před podáním ATB III akutní sepse 1. dvě hemokultury současně před začátkem ATB terapie 2. IV endokarditida 1. dvě hemokultury současně před začátkem ATB terapie pie hodiny po prvních odběrech V pac. neg. inic. hemok dodatečné hemokultury 2. a 3. den v době nejnižší hladiny ATB 2. 3.

12 Sensitivita Molekulární diagnostika septických stavů 1 bakterie/10 ml 1 bakterie/10 ul 0,1 bakterie/1 ml100 bakterií/1 ml 1000x Úroveň bakerinémie Dospělí10-80 baktérií / ml Děti>100 baktérií / ml

13 Sensitivita a spolehlivost Molekulární diagnostika septických stavů Kultivační metody Citlivější - až 1000x citlivější ve srovnání s PCR Nižší spolehlivost - závislost na viabilitě, ATB terapii, nutričních nárocích, délce životního cyklu Kultivačně nezávislé metody Nízká analytická sensitivita baktérií / ml Vysoká spolehlivost nad úrovní analytické citlivosti

14 Zvýšení sensitivity PCR metod Molekulární diagnostika septických stavů  Zakoncentrování vzorku během izolace NK  Zvyšování iniciačního objemu a snižováním objemu elučního  Selektivní izolace mikrobiální DNA (MolYsis™)

15 Zvýšení sensitivity PCR metod Molekulární diagnostika septických stavů  Zvýšení vkladu vzorku do PCR reakce  Zacílení do multikopiových sekvencí  Fungal ribosomal rDNA complex  5´ETS-18S rRNA-ITS1-5,8S rRNA-ITS2-28S rRNA- 3´ETS  repetitivních sekvencí na haploidní genom  0,15 buňky/PCR = 6 kopií/PCR = 3 buňky/ml  detekce ribosomální RNA  7000 – ribosómů / buňku  Marker rozlišení mrtvých organismů od aktivní infekce Dendis M, Horvath R, Michalek J, et al. PCR-RFLP detection and species identification of fungal pathogens in patients with febrile neutropenia. Clin Microbiol Infect 2003; 9:1191–202.

16 Falešně pozitivní výsledky Molekulární diagnostika septických stavů Nukleové kyseliny baktérií a hub nás doslova obklopují Pro průkaz nukleových kyselin neplatí mikrobiologická pravidla sterility

17 Falešně pozitivní výsledky Molekulární diagnostika septických stavů Bougnoux, M., C. Dupont, J. Mateo, P. Saulnier, V. Faivre, D. Payen, and M. Nicolas-Chanoine Serum is more suitable than whole blood for diagnosis of systemic candidiasis by nested PCR. J. Clin. Microbiol. 37:925–930 z důvodu detekce „mrtvých“ pathogenů v organismu Doba eliminace Živé buňky5 minut DNA z plné krve15 minut DNA ze séra150 minut Mrtvé mikroorganismy a jejich DNA jsou z krevního oběhu velmi rychle eliminovány Sérum a plasma můžou být vhodnějším materiálem pro detekci mikroorganismů z krve

18 Falešně pozitivní výsledky Molekulární diagnostika septických stavů Exogenní kontaminace  Nutno zajistit DNA sterilitu celého diagnostického procesu od odběrovek po výsledek a důsledné používání negativních kontrol  Interpretace pozitivního výsledku především neobvyklých nálezů musí být interpretována v kontextu možné exogenní kontaminace

19 Metody průkazu NK pathogenů Molekulární diagnostika septických stavů PCR Univerzální detekce Multiplex Univerzální detekce Náchylnost na kontaminaci Delší a náročnější Omezený počet patogenů Méně náchylné na kontaminaci Rychlejší a jednodušší

20 Úskalí interpretace výsledků Molekulární diagnostika septických stavů Primární detekce mikroorganismů, které rostou snáze Primární detekce mikroorganismů, kterých je ve vzorku více Z jednoho vzorku můžeme získat dva diametrálně rozdílné výsledky, přičemž oba jsou správně J. Gallo, M. Kolar, M. Dendis et al., “Culture and PCR analysis of joint fluid in the diagnosis of prosthetic joint infection,” New Microbiologica, vol. 31, no. 1, pp. 97–104, 2008.

21 Úskalí interpretace výsledků Molekulární diagnostika septických stavů Detekce nekultivovatelných a „obskurních“ mikroorganismů Grijalva M, Horváth R, Dendis M, Cerny J, Benedík J. Molecular diagnosis of culture negative infective endocarditis: clinical validation in a group of surgically treated patients. Heart 2003;89:263–268 Tropheryma whipplei

22 Molekulární diagnostika není lepší nebo horší než jiné diagnostické metody Molekulární diagnostika septických stavů Je pouze kolečkem v soukolí komplexního diagnostického procesu na jehož konci je vyléčený pacient

23 Děkuji za pozornost!


Stáhnout ppt "Molekulární diagnostika septických stavů Miloš Dendis."

Podobné prezentace


Reklamy Google