Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR Transport léčiv na polymerních nosičích Kurz „Biomateriály“, VŠCHT Praha.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR Transport léčiv na polymerních nosičích Kurz „Biomateriály“, VŠCHT Praha."— Transkript prezentace:

1 Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR Transport léčiv na polymerních nosičích Kurz „Biomateriály“, VŠCHT Praha

2 Obsah přednášky Úvod do problematiky polymerních nosičů biologicky aktivních molekul Přehled systémů pro řízené uvolňování léčiv Polymerní konjugáty biologicky aktivních molekul (léčiv), protinádorová terapie Polymery pro diagnostiku Polymery při přípravě vektorů pro genové terapie Závěr a výhledy

3 Proč polymery? Co umožní použití syntetických polymerů při přípravě léčiv a lékových forem? Konc čas [ hod] 048 dny - rok řízené uvolňovánícílený transport protrahovaný účinek řízené uvolňování Klasické nízkomolekulární léčivoPolymerní formy léčiv

4 Paul Ehrlich, 1908 „Magic Bullet“ Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního léčiva Nový obor zabývající se systémy pro dopravu léčiv „Drug delivery systems“ Controlled Release Society Advances in Drug Delivery Reviews Crical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems Journal of Controlled Release Journal of Drug Targeting Journal of Bioactive and Compatible Polymers Biomacromolecules Bioconjugate chemistry Macromolecular Bioscience Biomaterials

5 Požadavky na „ideální“ léčivo  Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami)  v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka)  aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci  působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku  léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

6 Polymerní systémy umožňující řízené uvolňování biologicky aktivních látek Systémy s řízeným uvolňováním BAL olejové kapky kapsule a potahované systémy matricové systémy membránové systémy mikroreservoáry systémy s aktivovaným uvolňováním Systémy pro cílený transport a řízené uvolňování BAL nano- a mikročástice, nanokapsule micely liposomy „prodrug“ systémy (ADEPT) rozpustné polymerní nosiče léčiv a konjugáty polymeru s proteinem polymerní systémy pro dopravu genu (genová terapie)

7 Olejové kapky léčivo Olejová kapka voda Rychlost uvolňování řízena difuzí závisí na rozdělovacím koeficientu olej-voda a rozpustnosti léčiva Materiál: sezamový olej, olivový olej, nízkomolekulární poly(orthoestery) Aplikace: transdermální, orální, parenterální podání Léčiva: léky nerozpustné nebo málo rozpustné ve vodě Consumpren (Cyclosporine - cyklický dekapeptid), Taxol, Docetaxel v oleji Lipidoil nebo Cremofor čas koncentrace

8 Tablety, kapsule a potahované systémy Materiál: Potah: želatina, polysacharidy, algináty, síťovaný albumin, Eudragity - kopolymery na bázi akrylátů a methakrylátů Matrice: Poly(ethylen oxid), Poly(vinylpyrrolidon) Poly(vinylalkohol) Uvolňování léčiva: - rychlost rozpouštění matrice - rychlost rozpouštění potahu - difuzí léčiva Použití: orální podávání čas koncentrace Polymerní vrstva Dispergované léčivo Polymerní matrice

9 Eudragity Eudradit L Stálý v kyselém prostředí Rozpustný v alkalickém prostředí Eudradit E Rozpustný v žaludku Maskování chuti léčiv Ochrana proti vlhkosti Eudradit RL Nerozpustné, botnají, zpožděné uvolňování

10 Matricové systémy a) Nedegradovatelné Uvolňování: řízeno difuzí čas koncentrace Materiál: Silikony, Polymethakryláty, polyakryláty, kopolymery vinylacetátu Aplikace: implantáty umožňující uvolňování léčiva po dobu i několika let poševní kroužky (hormonální antikoncepce) NuvaRing ® silikonový kaučuk obsahující levonorgestrel, megestrol acetate, progesterone (uvolňování po dobu 90 dnů s rychlostí uvolňování 20 μg/den Řízená difuze

11 Matricové systémy b) Degradovatelné – hydrofóbní polymer, povrchová erose polymeru Materiály: PLA/PGA kopolymery, poly(anhydridy), poly(orthoestery) Uvolňování: kombinace difuze a degradace, podle povahy léčiva Gliadel ® degradovatelný polymerní implantát na bázi polyanhydridů léčivo – Carmustine, BCNU, léčbě mozkových nádorů bis-phenoxykarboxypropan anhydrid kyseliny sebakové 20 % 80 % Atridox ® PLADoxycyclinOnemocnění dásní Nutropin Depot ® PLGArůstový hormonmalý vzrůst Lupron Depot ® PLAleuropeptiderakovina prostaty Zoladex ® PLAgoserelinrakovina prostaty

12 Matricové systémy b) Degradovatelné – hydrofilní gely, botnání, které vede až k rozpuštění gelu Materiál: Hydrogely na bázi kopolymerů (2-hydroxyetyl)methakrylátu N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu Uvolňování: kombinace difuse a degradace gelu Studovány gely obsahující kyselinu 5-aminosalicilovou, degradovatelné azoreduktásami přítomnými v tlustém střevě „Smart systems“, řízené uvolňování inzulinu z matrice s imobilizovanou glukosoxidásou

13 Membránové systémy pro dopravu léčiv zásobník léčiva membrána léčivo uvolňováno difusí přes membránu Poly(ethylenglykolmethakrylát) kopolymer ethylen-vinylacetát, silikonový kaučuk, síť. albumin

14 Transdermální systémy - náplasti Nezatěžuje GI trakt Prodloužená doba účinku Umožňuje aplikaci pacientem Neinvazivní metoda Zvyšuje pohodlí pacienta Snižuje vedlejší účinky Jednoduché odstranění zdroje léčiva Výhody: Nevýhody: Nízká prostupnost větších molekul přes pokožku Používání látek zlepšujících průnik léčiva pokožkou (DMSO) Dráždění pokožky Malá kapacita léčiva

15 Typy transdermálních systémů - náplastí Náplasti s polymerní matricí Roztok nebo suspenze léčiva je dispergován v polymerní matrici Náplasti s kapalným zásobníkem léčiva Roztok nebo suspenze léčiva je umístěn mezi ochrannou vrstvou a membránou, která řídí rychlost Náplasti s několika vrtvami polymerní matrice Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě i v polymerní matrici, oddělené membránou Náplasti s léčivem v adhezivní části Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě, v přímém kontaktu s pokožkou Krycí vrstva LéčivoMembrána Adhezivní vrstva Pokožka Polymerní matrice Zásobník léčiva Léčivo v adhezivní vrstvě Několika vrstevnaté

16 E-Trans ® systém umožňuje dopravu širšího spektra léčiv s terapeuticky dostatečnou rychlostí Zvýšení průniku léčiva přes pokožku – iontoforéza, elektroporace, ultrazvuk NázevOchranná vrstva Zásobník nebo matrice s léčivem MembránaAdhezivní vrstva Transderm Scop ® Aluminizovaný polyester scopolamine light mineral oil polyisobutylene mikroporézní polypropylén light mineral oil polyisobutylene Nicorette ® polyesterNikotin polyisobutylene polyisobutylen polybutylen Deponit ® polypropylénnitroglycerin polyakrylát polyisobutylen

17 Systémy s aktivovaným uvolňováním Uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem polopropustná membrána jádro s roztokem léčiva roztok léčiva polopropustná membrána osmotické jádro, osmoticky aktivní sůl pružná diafragma Zásobní roztok léčiva roztok léčiva Orálně aplikovatelné systémy pro řízené uvolňování léčiv OROS ® a OROS ® Push-Pull TM OROS ® OROS ® Push-Pull TM

18 Systémy s aktivovaným uvolňováním Implantáty - uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem Osmotická pumpa „Alzet“ Protilátky, chemotherapeutika, cytokiny, růstové faktory, hormony a peptidy

19 Nano a mikročásticové systémy Nanočástice: 5 – 1000 nm, mikročástice:  m Původně: Polymethylmethakrylát, polystyren poly(2-hydroxyethyl)methakrylát Biodegradovatelné: polykyanoakryláty, polyestery (PLA, PGA a jejich kopolymery), polyanhydridy, polyfosfazény. Albumin, želatina, ethylcelulosa, algináty mikrokapsule mikrosféry pasivní směrování: nm játra, RES  m plíce aktivní směrování: magnetit Fe 3 O 4

20 Materiály pro přípravu nanočástic a nanokapsulí Syntetické hydrofobní polymery Biodegradovatelné – polyestery (PLA, PGA, PLGA), polyanhydridy, poly(ortho estery), polykyanoakryláty Nebiodegradovatelné – silikonový kaučuk, polymethylmethakrylát, kopolymer ethylén - vinylacetát

21 Algináty: inearní kopolymer s homopolymerními bloky (1-4)-vázaného ß-D-mannuronátu (M) a jeho C-5 epimeru α-L-guluronátu (G) Hyaluronová kyselina Skládá se z disacharidických jednotek glukoronové kyseliny a N-acetyl- glukosaminu Chitosan: lineární polysacharid skládající se z náhodně distribuovaných ß-(1-4)-vázáných D- glukosaminových a N-acetyl-D- glukosaminových jednotek Přírodní hydrofilní materiály (hydrogely) albumin, želatina, karboxymethyl celulóza, dextrany, chitosan, algináty, hyaluronová kyselina

22 hydrofilní polymery vodorozpustné poly(ethylén oxid), poly(α-aminokyseliny), poly(vinylpyrrolidon), poly[N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid] (HPMA, ) Syntetické hydrofilní materiály, rozpustné polymery a hydrogely Požadavky na polymery: netoxické, biokompatibilní a neimunogenní hydrogely poly(2-hydroxyehtylmethakrylát) (HEMA), HPMA atd.

23 Micelární systémy blokové kopolymery typu A-B nebo A-B-A hydrofilní řetězec, PEG, PVP, PHEGlu hydrofobní řetězec, PMM, PS, PBzGlu, PBzAsp, PLA, PGA DOX kritická micelární koncentrace pro polymery – mol/L.

24 Liposomální systémy hydrofobní „ocas“ hydrofilní hlava hydrofilní léčivo hydrofobní léčivo poly(ethylen oxid) Příklad: Myocet ®, Doxil ® Doxorubicin.HCl AmBisome ® amphotericin B uměle připravené sférické částice o průměru okolo 0,1 – 1 μm tvořené membránou z fosfolipidové dvojvrstvy, podobné buněčné membráně

25 Druhy liposomů klasický kationtové imunoliposomy „Stealth“ dlouhocirkulující

26 Myocet ® – liposomální doxorubicin, Doxil ® – pegylovaný liposomální doxorubicin, pro léčbu metastázující rakoviny prsu N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol 2000)-1,2-distearoyl- sn -glycero- 3-phosphoethanolamine sodium salt (MPEG-DSPE), 3.19 mg/mL; fully hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), 9.58 mg/mL; and cholesterol, 3.19 mg/mL. MPEG-DSPE HSPC Doxorubicin.hydrochlorid více než 90 % DOX.HCl je v liposomu rozměr 100 nm

27 „Prodrug“ systémy (ADEPT) „antibody-directed enzyme prodrug therapy“ Ab E E E E E E E AlaAla--DOX DOX průnik do buňky zánik buňky neaktivní aktivní nádorová buňka Enzym Neaktivní léčivo Aktivní léčivo Alkalická fosfatáza Doxorubicin fosfát Doxorubicin Karboxypeptidáza A Methotrexát-alanin Methotrexát AlaAla--DOX

28 Vodorozpustné polymerní konjugáty s léčivy, polymerní diagnostika

29 Požadavky na „ideální“ léčivo  Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami)  v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka)  aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci  působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku  léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

30 Schéma klasického polymerního léčiva Léčivo Biodegradovatelná spojka (fosfát, cukr, oligopeptid, hydrolyticky štěpitelná spojka) Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka (IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid

31 Roubovaný polymer (pasivní směrování) HPMA kopolymer Reaktivní skupina Dedegradovatelná spojka Léčivo Protilátka (peptid) (směrující skupina) Lipofilní substituent Adenovirus (genová terapie) (a) Gd (MRI) (b) Radionuklid (c) Fluorescenční značka Schéma struktur polymerních konjugátů založených na multivalentním prekurzoru

32 Multivalentní HPMA kopolymery používané pro syntézu polymerních konjugátů (příklad nejpoužívanějších struktur) Příprava klasickou a nebo řízenou (RAFT) radikálovou polymerizací NH C CH 2 S H NH 2 + CCH 2 CH 3 CO NH CH 2 CH CH 3 OH CCH 2 CH 3 CO CO NH CH 2 NH x y NH2H2 CCH 2 CH 3 CO Gly z NH CH 2 CH 2 Cl 3 5 NH b CH 2 C CH 3 CO x CH 2 C CH 3 CO NH CH 2 CH CH 3 OH CH 2 C CH 3 CO NH CH 2 CH CH 3 OH CH 2 C CH 3 CO N S S SH NH 2 R-C=O

33 Semitelechelické reaktivní polymerní prekursory syntézy polymerních konjugátů léčiv (HPMA kopolymery) Polymer s navázaným léčivem a koncovou funkční skupinou Polymer s funkčními skupinami (a)Bifunkční iniciátor (b)Polymerizace s přenosem (c)Řízená polymerizace (RAFT) (a) (b) HS-(CH 2 ) 2 -COOH

34 Možnosti uvolňování léčiva z polymerního nosiče Cévy (a) (b) (c) a)Uvolnění v krevním řečišti b)Uvolnění ve tkáni po extravazaci c)Specifické uvolnění v cílových buňkách po endocytose

35 Interakce polymerních léčiv s buňkami Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech Jádro primární endosom pH sekundární lysosom, pH 5, enzymy lysosom

36 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu = chemická vazba léčiva na nosič Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

37 Schéma klasického konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicinem (enzymatická aktivace léčiva) Enzymaticky degradovatelný oligopeptid: -GlyPheLeuGly- Místo enzymatického štěpení O HO CH 3 OH OH OCH 3 O O HO CCH 2 HO O O NH a x CH 2 C CH 3 CH 2 C CH 3 CCOO NH CH 2 CH CH 3 OH

38 Schéma hydrazonového konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicin (pH závislá hydrolytická aktivace léčiva) Jednoduchá vazba nebo spacerMísto hydrolytického štěpení

39 Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič) Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv

40 Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z polymerního nosiče S1S1 S3S3 S4S4 S2S2 S3´S3´ S1´S1´ S2´S2´ P1P1 P2P2 P3P3 P4P4 P1P1 P1´P1´ P2´P2´ P3´P3´ Gly-Phe-Leu-Gly--- Aktivní místo enzymu (proteázy) NAp Substrát (oligopeptid) polymer Model léčiva, léčivo (DOX) Spojka (oligopeptid) ENZYM

41 Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX konjugátů se směsí lysosomálních enzymů - tritosomů STRUKTURA% UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU 3 h6 h24 h -GFLG GLFG GG

42 pH 5.5 pH 7.4 Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém pH

43 Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič) Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv

44 Princip pasivního směrování – akumulace polymerů v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.) Normální tkáň Nádorová tkáň Fungující lymfatický systém Málo propustný endothel Porézní kapilární systém Těsné kapiláry nebo chybějící lymfatický systém

45 Distribuce poly(HPMA) v myších (EPR efekt), Sarkom 180 (melanom B16F10) (i.v. injekce polymeru)

46 Konjugáty umožňující pasivní směrování do nádorů Nedegradovatelné polymerní nosiče (limit Mw ~ g/mol) Multiblokové biodegradovatelné nosiče Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní nosiče PEG Micelární nosiče léčiv

47 + + A) B) G F L G G F L G G F L G NH NH 2 NH NH 2 S S S S S S NH NH 2 Dox=NNH NHN=Dox N=Dox NH N=Dox NH N=Dox NH NHN=Dox Dox=NNH N=Dox NH Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným uvolňováním Dox a řízenou biodegradací

48 Struktura micelárního PHPMA-DOX konjugátu (s cholesterolem a pH-řízeným uvolňováním DOX) M w (pol) = 32 kDa I = 1.8 M w (mic) = 170 kDa [DOX] = 7 wt% [cholesteryl] = 3.5 %mol d mic = 22 nm Vodné prostředí

49 Dendritické polymery, syntéza G1 G2 M w ~ I n ~1.8 to 2.3 R h ~ nm M w ~ I n ~2.0 to 2.6 R h ~ nm MW~1550 Diameter~ 2.2 nm NH 2 number = 8 MW~3300 Diameter~ 2.9 nm NH 2 number = 16 Polyamidoaminové jádro PAA dendrimer druhé generace PAA dendrimer třetí generace Semitelechelický HPMA kopolymer

50 Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem. Eliminace z oběhuAkumulace v nádoru

51 Aktivní směrování – internalizace polymerních léčiv v buňkách Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech Jádro primární endosom pH sekundární lysosom, pH 5, enzymy lysosom

52 Schéma klasického protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) O HO CH 3 OH OH OCH 3 O O HO CCH 2 HO O O NH Oligopeptid -GlyPheLeuGly-

53 DOX S-CH 2 CH 2 -CONH-- Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) X

54 Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič) Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv

55 Schéma degradace roubovaného konjugátu (degradace v reduktivním prostředí buňky) NH NH 2 NH N NH N NH NH 2 NH N NH N NH N = NH NH 2 =DOX DOX= DOX S S S S S S S Degradace v cílové buňce DOX Vysokomolekulární léčivo s akumulací v pevném nádoru Nížemolekulární fragmenty vyloučitelné z organizmu

56 Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B) = mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou -S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion) = mol/l Vylučovací mez polymeru ledvinami

57 Biologická aktivita polymerních léčiv studovaná na modelových nádorech u myší (růst nádoru, doba přežití, váha) (a) Testy in vitro aktivity na buněčných liniích (b) In vivo testy na myších, terapeutický režim aplikace léčiva ( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 – 11 dnech od inokulace)

58 Inhibice proliferace buněk EL4 T-buněčné leukemie (IC 50 – koncentrace potřebná pro inhibici proliferace 50 % buněk) Konjugát IC 50, μg DOX/mL PHPMA-GFLG -DOX (PK1)19.1 PHPMA-GFLG -DOX-ATG11,8 PHPMA-GFLG -DOX (cis-aconityl)4.74 PHPMA-GFLG -DOX (hydrazon)0.13 PHPMA-GG -DOX (hydrazon)0.08 PHPMA-aminohexanová kys.-DOX (hydrazon) 0.34 PHPMA-aminobenzoic ac.-DOX (hydrazon) 0.07 PHPMA-GFLG -DOX-ATG (hydrazon)0.01 PHPMA-GFLG -DOX-NHNH 2 (prekurzor)100 DOX.HCl0.01

59 Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů (Balb/c myši, BCL1 leukemie i.p., léčba i.v.) a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl)

60 Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x10 5, s.c.) doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-DOX konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den

61 Léčba myší kmene B/6 s nádorem myšího EL-4 T- buněčného lymfomu pomocí konjugátu HuIgG- PHPMA-DOX Injekce jedné dávky i.v. 20 mg/kg DOX v den 10

62 Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární konjugát Myší T-buněčný lymfom EL4, myši C57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den Hydrolyticky štěpitelná vazba, pH závislá rychlost štěpení

63 Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty DOX (Hydrazon) – In vivo protinádorová aktivita 10 5 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v., jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg A – konjugát s enzymatickou degradací B – konjugát s reduktivní degradací

64 Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčným lymfomem (s.c.) léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva

65 Přežití C57BL/6 myší s retransplanovanými buňkami (10 5 ) myšího lymfomu EL-4, bez následné léčby Původní léčba: hydrazonový konjugát

66

67 Využití rozpustných polymerních konjugátů v diagnostice

68 Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii) magnetickou resonancí Hmotová spektroskopie: (5.19±0.28) %váh. Gd Kontrastní látka: 0.5 M (78 mg/ml Gd) MW: 24.8 kDa M w /M n : 1.92

69 Doba inkubace: 2 měsíce Relaxační časy T 1, T 2 (podélná a příčná vibrace) Stabilita komplexu Gd-PHPMA Stabilita komplexů - ve fyziologickém roztoku (0,9 % NaCl) - ve vodě

70 Cytotoxicita konjugátů gadolinia (lidské fibroblasty, trypan blue, kontrola Gd-DTPA (Magnevist) od firmy Schering) Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM ) 24 hodin48 hodin Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM) Dead human fibroblast cells (MSU) [%] Doba inkubace

71 MR-Angiografie, komplex poly(HPMA)-Gd Krysa, 1.5 T MR scanner:0.02 mmol/kg HE45

72 Syntetické polymery jako součást vektorů pro genovou terapii

73 Požadavky na systém pro dopravu genu účinný v in vivo podmínkách 1.Stabilita v krevním řečišti, minimální interakce s buňkami imunitního systému 2.Extravazace do cílové tkáně 3.Interakce s receptory cílových buněk 4.Endocytoza 5.Únik z endosomu do cytoplasmy 6.Transport k buněčnému jádru 7.Účinná transfekce a produkce aktivního proteinu

74 Systémy pro in vivo dopravu genu Biodegradovatelné nanočástice Kationtové liposomy Kationtové lipidy (lipoplexy) Interpolyelektrolytové (polykationtové) komplexy DNA (polyplexy) Virální systémy: retroviry, polymerem modifikované rekombinantní adenoviry

75 Interpolyelektrolytové komplexy (IPEC) polykationtů s DNA plasmidy (polyplexy)

76 Tvorba komplexu polykation-DNA /- = 1 : 1 +/- >> 1 Agregace částic Izolované komplexy Směs polymeru s komplexem /- > 1

77 a) Primární amínyb) Terciární amínyc) Kvarterní ammoniové soli MAEDA MAGEDA MAGGHMDA DMAEMDMAEMamTMAEMTMAEMam Polykationty použité pro přípravu IPEC a) Primární amínyb) Terciární amínyc) Kvarterní ammoniové soli MAEDA MAGEDA MAGGHMDA DMAEMDMAEMamTMAEMTMAEMam CH 2 C CH 3 CO O (CH 2 ) 2 N CH 3 H 3 C CH 2 C CH 3 CO NH (CH 2 ) 2 NH 3 C CH 3 CH 3 Cl - CH 2 C CH 3 CO O (CH 2 ) 2 NH 3 C CH 3 CH 3 Cl -

78 PVA PEI Polykationty použitelné pro přípravu IPEC CH 2 CH NH CO H CH 2 CH 2 NHCH 2 CH 2 N CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 CH 2 NH AIBN CH 2 CH NH CO H NaOH PLL HNCHCO CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 CH 2 CH NH 2

79 Multifunkční polykationtový vektor pro dopravu genu připravený kondensací DNA s blokovými kopolymery polykationtů a hydrofilních polymerů Fusogení molekula (peptid) Směrující jednotka Hydrolyticky labilní vazba (při pH < 6) plasmid pH 7,4 stabilní při dopravě Uvnitř buňky při pH < 6 se plasmid uvolní z endosomu

80 Stabilita polykationtového komplexu DNA stabilizovaného hydrofilním PHPMA kopolymerem při inkubaci s DNAzou (fosfátový pufr, pH 7.4, 37 °C)

81 NH 2 ONp + NH 2 + Povrchová úprava IPEC pomocí HPMA kopolymeru, využití pro cílenou dopravu IPEC pomocí aktivních proteinů nebo oligopeptidů NH 2 ONp NH oligopeptid protein (IgG, transferin)

82 Průnik do buněk K562 (lidská leukemie) a účinnost transfekce komplexů pLL/DNA (gen kódující ß-Gal). Směrování transferinem. Průnik PL/DNA komplexu do buněk, vliv směrováníÚčinnost přenosu genu v in vitro podmínkách

83 Virální systémy, rekombinantní adenoviry

84 Požadavky na intravenozní aplikaci: Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily Nesmí napadat makrofágy a buňky RES Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a komplementem Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách Musí být schopen specifického směrování k vybraným buňkám (retargeting) Adenovir: Potenciální vektor pro nádorovou genovou terapii Receptory: coxsackie a adenovirus receptory (CAR), receptory pro „fibre knob“ ligandy

85 Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem + + Semitelechelický monovalentní polymer Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou Modifikovaný virus Aminoskupina Reaktivní esterová skupina Virus

86 pH < 6 GSH Buněčná membrána Směrující struktura endosom Extracelární prostředí Ochranný polymer adenovirová kapsida Degradovatelné vazby Prostředí v buňce Přesměrovaný virus Uvolnění DNA Osud povrchově modifikovaného viru v cílové buňce

87 Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou úpravu virálních nosičů genu CH 2 C CH 3 CO NH CH 2 CH CH 3 OH CH 2 C CH 3 CO O (CH 2 ) 2 NCH 3 CH 3 CH 3 CH 2 C CH 3 CO NH (CH 2 ) 2 CO N S S (CH 2 ) 2 NH CO (CH 2 ) 2 S S CH 2 C CH 3 CO NH (CH 2 ) 2 CO (CH 2 ) 2 NH CO (CH 2 ) 2 S S Cl EGF Reduktivně štěpitelná vazba (v cytoplasmě)

88 Množství nemodifikovaných a polymerem modifikovaných virů v krvi po 30 min od aplikace (% vstupní dávky, myši BALB/C) Modifikace viru polymerem a vhodná dávka vede ke snížení poměru počtu virů v játrech vers. krev z poměru >2000 na <1.

89 Nemodifikovaný virus Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 – plicní nádor) Transgenní exprese genu Ad5-GFP Polymerem modifikovaný virus Asociace s buňkami (FACS) Virus retargetovaný pomocí bFGF

90 Retargeting adenoviru (Ad5-luc) pomocí EGF (epidermální růstový faktor) Vaginální nádor A431Ovariální nádor SKOV viruspc-virusEGF-pc-virus Luciferase (RLU) viruspc-virusEGF-pc-virus Luciferase (RLU)

91 SKOV3 Ovariální nádor K562 Lidská leukemie BuňkyVirus PHPMA modi- fikovaný virus Herceptinem retargetovaný virus Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem

92  Polykationty tvoří dostatečně malé a stabilní komplexy s DNA a plasmidy  Stabilitu polykationt/DNA komplexu je možné ovlivňovat strukturou polykationtu a modifikací povrchu komplexu hydrofilním polymerem  Účinnost transfekce IPE komplexů může být ovlivňována změnami struktury komplexu a zavedením funkčních molekul (směrování)  Modifikace adenoviru hydrofilním HPMA kopolymerem vede k prodloužené cirkulaci viru v krvi a až k 1000 násobné redukci exprese genu (poklesu nespecificke infektivity).  Expresi genu je možné obnovit specifickým směrováním polymerem modifikovaného viru pomocí specifických oligopeptidů i proteinů (transferin, herceptin).  Specifita směrování virálního vektoru je výrazně závislá na struktuře směrující molekuly  IPEC i polymerem modifikované viry jsou slibnými vektory s potenciálním využitím v genové terapii Závěry


Stáhnout ppt "Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR Transport léčiv na polymerních nosičích Kurz „Biomateriály“, VŠCHT Praha."

Podobné prezentace


Reklamy Google