Stáhnout prezentaci
Prezentace se nahrává, počkejte prosím
1
Transport léčiv na polymerních nosičích
Kurz „Biomateriály“, VŠCHT Praha Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR
2
Obsah přednášky Úvod do problematiky polymerních nosičů biologicky aktivních molekul Přehled systémů pro řízené uvolňování léčiv Polymerní konjugáty biologicky aktivních molekul (léčiv), protinádorová terapie Polymery pro diagnostiku Polymery při přípravě vektorů pro genové terapie Závěr a výhledy
3
Proč polymery? Co umožní použití syntetických polymerů při přípravě léčiv a lékových forem?
Konc čas [ hod] 4 8 dny - rok Klasické nízkomolekulární léčivo Polymerní formy léčiv řízené uvolňování protrahovaný účinek řízené uvolňování cílený transport
4
Paul Ehrlich, 1908 „Magic Bullet“
Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního léčiva Nový obor zabývající se systémy pro dopravu léčiv „Drug delivery systems“ Controlled Release Society Advances in Drug Delivery Reviews Crical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems Journal of Controlled Release Journal of Drug Targeting Journal of Bioactive and Compatible Polymers Biomacromolecules Bioconjugate chemistry Macromolecular Bioscience Biomaterials
5
Požadavky na „ideální“ léčivo
Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami) v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka) aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu
6
Polymerní systémy umožňující řízené uvolňování biologicky aktivních látek
Systémy s řízeným uvolňováním BAL olejové kapky kapsule a potahované systémy matricové systémy membránové systémy mikroreservoáry systémy s aktivovaným uvolňováním Systémy pro cílený transport a řízené uvolňování BAL nano- a mikročástice, nanokapsule micely liposomy „prodrug“ systémy (ADEPT) rozpustné polymerní nosiče léčiv a konjugáty polymeru s proteinem polymerní systémy pro dopravu genu (genová terapie)
7
Olejové kapky Rychlost uvolňování řízena difuzí
Olejová kapka léčivo koncentrace voda čas Rychlost uvolňování řízena difuzí závisí na rozdělovacím koeficientu olej-voda a rozpustnosti léčiva Materiál: sezamový olej, olivový olej, nízkomolekulární poly(orthoestery) Aplikace: transdermální, orální, parenterální podání Léčiva: léky nerozpustné nebo málo rozpustné ve vodě Consumpren (Cyclosporine - cyklický dekapeptid), Taxol, Docetaxel v oleji Lipidoil nebo Cremofor
8
Tablety, kapsule a potahované systémy
Dispergované léčivo koncentrace Polymerní vrstva Polymerní matrice čas Materiál: Potah: želatina, polysacharidy, algináty, síťovaný albumin, Eudragity - kopolymery na bázi akrylátů a methakrylátů Matrice: Poly(ethylen oxid), Poly(vinylpyrrolidon) Poly(vinylalkohol) Uvolňování léčiva: rychlost rozpouštění matrice rychlost rozpouštění potahu difuzí léčiva Použití: orální podávání
9
Eudragity Eudradit L Eudradit E Eudradit RL Stálý v kyselém prostředí
Rozpustný v alkalickém prostředí Eudradit E Rozpustný v žaludku Maskování chuti léčiv Ochrana proti vlhkosti Eudradit RL Nerozpustné, botnají, zpožděné uvolňování
10
Uvolňování: řízeno difuzí
Matricové systémy a) Nedegradovatelné koncentrace Řízená difuze čas Uvolňování: řízeno difuzí Materiál: Silikony, Polymethakryláty, polyakryláty, kopolymery vinylacetátu Aplikace: implantáty umožňující uvolňování léčiva po dobu i několika let poševní kroužky (hormonální antikoncepce) NuvaRing® silikonový kaučuk obsahující levonorgestrel, megestrol acetate, progesterone (uvolňování po dobu 90 dnů s rychlostí uvolňování μg/den
11
Matricové systémy b) Degradovatelné – hydrofóbní polymer, povrchová erose polymeru Materiály: PLA/PGA kopolymery, poly(anhydridy), poly(orthoestery) Uvolňování: kombinace difuze a degradace, podle povahy léčiva Atridox® PLA Doxycyclin Onemocnění dásní Nutropin Depot® PLGA růstový hormon malý vzrůst Lupron Depot® leuropeptide rakovina prostaty Zoladex® goserelin Gliadel® degradovatelný polymerní implantát na bázi polyanhydridů léčivo – Carmustine, BCNU, léčbě mozkových nádorů bis-phenoxykarboxypropan anhydrid kyseliny sebakové 20 % %
12
Matricové systémy b) Degradovatelné – hydrofilní gely, botnání, které vede až k rozpuštění gelu Materiál: Hydrogely na bázi kopolymerů (2-hydroxyetyl)methakrylátu N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu Uvolňování: kombinace difuse a degradace gelu Studovány gely obsahující kyselinu 5-aminosalicilovou, degradovatelné azoreduktásami přítomnými v tlustém střevě „Smart systems“, řízené uvolňování inzulinu z matrice s imobilizovanou glukosoxidásou
13
Membránové systémy pro dopravu léčiv
zásobník léčiva membrána léčivo uvolňováno difusí přes membránu Poly(ethylenglykolmethakrylát) kopolymer ethylen-vinylacetát, silikonový kaučuk, síť. albumin
14
Transdermální systémy - náplasti
Nezatěžuje GI trakt Prodloužená doba účinku Umožňuje aplikaci pacientem Neinvazivní metoda Zvyšuje pohodlí pacienta Snižuje vedlejší účinky Jednoduché odstranění zdroje léčiva Výhody: Nevýhody: Nízká prostupnost větších molekul přes pokožku Používání látek zlepšujících průnik léčiva pokožkou (DMSO) Dráždění pokožky Malá kapacita léčiva
15
Typy transdermálních systémů - náplastí
Náplasti s polymerní matricí Roztok nebo suspenze léčiva je dispergován v polymerní matrici Náplasti s kapalným zásobníkem léčiva Roztok nebo suspenze léčiva je umístěn mezi ochrannou vrstvou a membránou, která řídí rychlost Náplasti s několika vrtvami polymerní matrice Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě i v polymerní matrici, oddělené membránou Náplasti s léčivem v adhezivní části Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě, v přímém kontaktu s pokožkou Polymerní matrice Zásobník léčiva Léčivo v adhezivní vrstvě Několika vrstevnaté Krycí vrstva Léčivo Membrána Adhezivní vrstva Pokožka
16
E-Trans® systém umožňuje dopravu širšího spektra léčiv s terapeuticky
Název Ochranná vrstva Zásobník nebo matrice s léčivem Membrána Adhezivní vrstva Transderm Scop® Aluminizovaný polyester scopolamine light mineral oil polyisobutylene mikroporézní polypropylén light mineral oil polyisobutylene Nicorette® polyester Nikotin polyisobutylene polyisobutylen polybutylen Deponit® polypropylén nitroglycerin polyakrylát E-Trans® systém umožňuje dopravu širšího spektra léčiv s terapeuticky dostatečnou rychlostí Zvýšení průniku léčiva přes pokožku – iontoforéza, elektroporace, ultrazvuk
17
Systémy s aktivovaným uvolňováním
Orálně aplikovatelné systémy pro řízené uvolňování léčiv OROS® a OROS® Push-PullTM Uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem polopropustná membrána jádro s roztokem léčiva roztok léčiva osmotické jádro, osmoticky aktivní sůl pružná diafragma Zásobní roztok léčiva OROS® OROS® Push-PullTM
18
Osmotická pumpa „Alzet“
Systémy s aktivovaným uvolňováním Implantáty - uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem Osmotická pumpa „Alzet“ Protilátky, chemotherapeutika, cytokiny, růstové faktory, hormony a peptidy
19
Nano a mikročásticové systémy
Nanočástice: 5 – 1000 nm, mikročástice: mm pasivní směrování: nm játra, RES mm plíce aktivní směrování: magnetit Fe3O4 Původně: Polymethylmethakrylát, polystyren poly(2-hydroxyethyl)methakrylát Biodegradovatelné: polykyanoakryláty, polyestery (PLA, PGA a jejich kopolymery), polyanhydridy, polyfosfazény. Albumin, želatina, ethylcelulosa, algináty mikrokapsule mikrosféry
20
Materiály pro přípravu nanočástic a nanokapsulí
Syntetické hydrofobní polymery Biodegradovatelné – polyestery (PLA, PGA, PLGA), polyanhydridy, poly(ortho estery), polykyanoakryláty Nebiodegradovatelné – silikonový kaučuk, polymethylmethakrylát, kopolymer ethylén - vinylacetát
21
Přírodní hydrofilní materiály (hydrogely)
albumin, želatina, karboxymethyl celulóza, dextrany, chitosan, algináty, hyaluronová kyselina Hyaluronová kyselina Skládá se z disacharidických jednotek glukoronové kyseliny a N-acetyl-glukosaminu Algináty: inearní kopolymer s homopolymerními bloky (1-4)-vázaného ß-D-mannuronátu (M) a jeho C-5 epimeru α-L-guluronátu (G) Chitosan: lineární polysacharid skládající se z náhodně distribuovaných ß-(1-4)-vázáných D-glukosaminových a N-acetyl-D-glukosaminových jednotek
22
Syntetické hydrofilní materiály, rozpustné polymery a hydrogely
hydrofilní polymery • vodorozpustné poly(ethylén oxid), poly(α-aminokyseliny), poly(vinylpyrrolidon), poly[N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid] (HPMA, ) hydrogely poly(2-hydroxyehtylmethakrylát) (HEMA), HPMA atd. Požadavky na polymery: netoxické, biokompatibilní a neimunogenní
23
Micelární systémy DOX kritická micelární koncentrace
blokové kopolymery typu A-B nebo A-B-A hydrofilní řetězec, PEG, PVP, PHEGlu hydrofobní řetězec, PMM, PS, PBzGlu, PBzAsp, PLA, PGA kritická micelární koncentrace pro polymery – 10-7 mol/L. DOX
24
Liposomální systémy Příklad: Myocet®, Doxil® AmBisome® amphotericin B
uměle připravené sférické částice o průměru okolo 0,1 – 1 μm tvořené membránou z fosfolipidové dvojvrstvy, podobné buněčné membráně hydrofilní hlava hydrofobní „ocas“ hydrofilní léčivo hydrofobní léčivo poly(ethylen oxid) Příklad: Myocet®, Doxil® Doxorubicin.HCl AmBisome® amphotericin B
25
Druhy liposomů klasický imunoliposomy + + + + + +
„Stealth“ dlouhocirkulující kationtové
26
více než 90 % DOX.HCl je v liposomu
Myocet® – liposomální doxorubicin, Doxil® – pegylovaný liposomální doxorubicin, pro léčbu metastázující rakoviny prsu N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol 2000)-1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine sodium salt (MPEG-DSPE), 3.19 mg/mL; fully hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), 9.58 mg/mL; and cholesterol, 3.19 mg/mL. HSPC MPEG-DSPE více než 90 % DOX.HCl je v liposomu rozměr 100 nm Doxorubicin.hydrochlorid
27
„Prodrug“ systémy (ADEPT)
„antibody-directed enzyme prodrug therapy“ Ab E AlaAla--DOX nádorová buňka AlaAla--DOX DOX průnik do buňky zánik buňky neaktivní aktivní Ab E Enzym Neaktivní léčivo Aktivní léčivo Alkalická fosfatáza Doxorubicin fosfát Doxorubicin Karboxypeptidáza A Methotrexát-alanin Methotrexát
28
Vodorozpustné polymerní konjugáty s léčivy, polymerní diagnostika
29
Požadavky na „ideální“ léčivo
Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami) v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka) aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu
30
Schéma klasického polymerního léčiva
Biodegradovatelná spojka (fosfát, cukr, oligopeptid, hydrolyticky štěpitelná spojka) Léčivo Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka (IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid
31
Schéma struktur polymerních konjugátů založených na multivalentním prekurzoru
(a) Gd (MRI) (b) Radionuklid (c) Fluorescenční značka Lipofilní substituent HPMA kopolymer Reaktivní skupina Dedegradovatelná spojka Adenovirus (genová terapie) Léčivo Protilátka (peptid) (směrující skupina) Roubovaný polymer (pasivní směrování)
32
Multivalentní HPMA kopolymery používané pro syntézu polymerních konjugátů (příklad nejpoužívanějších struktur) Příprava klasickou a nebo řízenou (RAFT) radikálovou polymerizací N H C 2 S + 3 O x y H2 Gly z Cl 5 b SH NH2 R-C=O
33
Semitelechelické reaktivní polymerní prekursory syntézy polymerních konjugátů léčiv (HPMA kopolymery) Bifunkční iniciátor Polymerizace s přenosem Řízená polymerizace (RAFT) (a) C ( H 2 ) N 3 O S G l y P h e L u (b) HS-(CH2)2-COOH C H 2 3 O N x y H2 S 5 Polymer s navázaným léčivem a koncovou funkční skupinou Polymer s funkčními skupinami
34
Možnosti uvolňování léčiva z polymerního nosiče
(b) (c) (a) Uvolnění v krevním řečišti Uvolnění ve tkáni po extravazaci Specifické uvolnění v cílových buňkách po endocytose Cévy Cévy
35
Interakce polymerních léčiv s buňkami Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech lysosom primární endosom pH 5 - 6 Jádro sekundární lysosom, pH 5, enzymy
36
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu = chemická vazba léčiva na nosič Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)
37
Schéma klasického konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicinem
(enzymatická aktivace léčiva) O H C 3 2 NH a x N Enzymaticky degradovatelný oligopeptid: -GlyPheLeuGly- Místo enzymatického štěpení
38
Schéma hydrazonového konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicin (pH závislá hydrolytická aktivace léčiva) N H O C 3 2 . l a x Jednoduchá vazba nebo spacer Místo hydrolytického štěpení
39
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)
40
Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z polymerního nosiče
Gly-Phe-Leu-Gly--- NAp Model léčiva, léčivo (DOX) Spojka (oligopeptid) P4 P3 P2 P1 P1´ P1 P2´ P3´ Substrát (oligopeptid) S4 S3 S2 S1 S1´ S2´ S3´ Aktivní místo enzymu (proteázy) ENZYM
41
% UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU
Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX konjugátů se směsí lysosomálních enzymů - tritosomů STRUKTURA % UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU 3 h 6 h 24 h -GFLG- 0.7 0.8 1.9 -GLFG- 0.5 1.5 -GG- 0.1 0.2
42
Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém pH
43
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)
44
Princip pasivního směrování – akumulace
polymerů v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.) Nádorová tkáň Normální tkáň Málo propustný endothel Porézní kapilární systém Fungující lymfatický systém Těsné kapiláry nebo chybějící lymfatický systém
45
Distribuce poly(HPMA) v myších (EPR efekt),
Sarkom 180 (melanom B16F10) (i.v. injekce polymeru)
46
Konjugáty umožňující pasivní směrování do nádorů
Nedegradovatelné polymerní nosiče (limit Mw ~ g/mol) Micelární nosiče léčiv PEG PEG PEG Multiblokové biodegradovatelné nosiče Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní nosiče
47
Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným uvolňováním Dox a řízenou biodegradací
2 A) N=Dox NH G L F G G F L N=Dox NH G G F L G NHN=Dox + Dox=NNH Dox=NNH B) N=Dox NH N H N H 2 N=Dox NH S S S S N H S + N H 2 S NHN=Dox NHN=Dox Dox=NNH Dox=NNH
48
Struktura micelárního PHPMA-DOX konjugátu (s cholesterolem a pH-řízeným uvolňováním DOX)
Vodné prostředí Mw(pol) = 32 kDa I = 1.8 Mw(mic) = 170 kDa [DOX] = 7 wt% [cholesteryl] = 3.5 %mol dmic = 22 nm
49
Dendritické polymery, syntéza
Polyamidoaminové jádro G2 G1 MW~1550 Diameter~ 2.2 nm NH2 number = 8 MW~3300 Diameter~ 2.9 nm NH2 number = 16 PAA dendrimer druhé generace Semitelechelický HPMA kopolymer PAA dendrimer třetí generace Mw~ In~2.0 to 2.6 Rh~ nm Mw~ In~1.8 to 2.3 Rh~ nm
50
Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem. Eliminace z oběhu Akumulace v nádoru
51
Aktivní směrování – internalizace polymerních léčiv v buňkách Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech lysosom primární endosom pH 5 - 6 Jádro sekundární lysosom, pH 5, enzymy
52
Schéma klasického protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
3 2 NH Oligopeptid -GlyPheLeuGly-
53
Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
S-CH2CH2-CONH-- DOX X
54
Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)
55
Schéma degradace roubovaného konjugátu
(degradace v reduktivním prostředí buňky) N H N H 2 DOX DOX= N N H N H S =DOX N S S Degradace v cílové buňce DOX S S N H N H S 2 S =DOX N H N =DOX N H N DOX DOX = N H N H N H N 2 Vysokomolekulární léčivo s akumulací v pevném nádoru Nížemolekulární fragmenty vyloučitelné z organizmu
56
c(kathepsin B) = 5.10-7 mol/l c(glutathion) = 3.10-6 mol/l
Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B) = mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou -S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion) = mol/l Vylučovací mez polymeru ledvinami
57
(růst nádoru, doba přežití, váha)
Biologická aktivita polymerních léčiv studovaná na modelových nádorech u myší (růst nádoru, doba přežití, váha) (a) Testy in vitro aktivity na buněčných liniích (b) In vivo testy na myších, terapeutický režim aplikace léčiva ( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 – 11 dnech od inokulace)
58
Inhibice proliferace buněk EL4 T-buněčné leukemie
(IC50 – koncentrace potřebná pro inhibici proliferace 50 % buněk) Konjugát IC50, μg DOX/mL PHPMA-GFLG -DOX (PK1) 19.1 PHPMA-GFLG -DOX-ATG 11,8 PHPMA-GFLG -DOX (cis-aconityl) 4.74 PHPMA-GFLG -DOX (hydrazon) 0.13 PHPMA-GG -DOX (hydrazon) 0.08 PHPMA-aminohexanová kys.-DOX (hydrazon) 0.34 PHPMA-aminobenzoic ac.-DOX (hydrazon) 0.07 PHPMA-GFLG -DOX-ATG (hydrazon) 0.01 PHPMA-GFLG -DOX-NHNH2 (prekurzor) 100 DOX.HCl
59
Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů (Balb/c myši, BCL1 leukemie i.p., léčba i.v.)
a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl)
60
Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x105, s. c. ) doxorubicinem (5x2
Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x105, s.c.) doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-DOX konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den
61
Injekce jedné dávky i.v. 20 mg/kg DOX v den 10
Léčba myší kmene B/6 s nádorem myšího EL-4 T-buněčného lymfomu pomocí konjugátu HuIgG-PHPMA-DOX Injekce jedné dávky i.v. 20 mg/kg DOX v den 10
62
Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární konjugát Myší T-buněčný lymfom EL4, myši C57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den Hydrolyticky štěpitelná vazba, pH závislá rychlost štěpení
63
Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty DOX (Hydrazon) – In vivo protinádorová aktivita
105 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v. , jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg A – konjugát s enzymatickou degradací B – konjugát s reduktivní degradací
64
Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX
Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčným lymfomem (s.c.) léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva
65
Přežití C57BL/6 myší s retransplanovanými buňkami (105) myšího lymfomu EL-4, bez následné léčby Původní léčba: hydrazonový konjugát
67
Využití rozpustných polymerních konjugátů v diagnostice
68
Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii) magnetickou resonancí
Hmotová spektroskopie: (5.19±0.28) %váh. Gd Kontrastní látka: 0.5 M (78 mg/ml Gd) MW: 24.8 kDa Mw/Mn: 1.92
69
Stabilita komplexu Gd-PHPMA
Doba inkubace: 2 měsíce Relaxační časy T1, T2 (podélná a příčná vibrace) Stabilita komplexů ve fyziologickém roztoku (0,9 % NaCl) ve vodě
70
Cytotoxicita konjugátů gadolinia
(lidské fibroblasty, trypan blue, kontrola Gd-DTPA (Magnevist) od firmy Schering) Doba inkubace 24 hodin 48 hodin Dead human fibroblast cells (MSU) [%] Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM) Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM)
71
MR-Angiografie, komplex poly(HPMA)-Gd
Krysa, 1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg HE45
72
Syntetické polymery jako součást vektorů pro genovou terapii
73
Požadavky na systém pro dopravu genu účinný v in vivo podmínkách
Stabilita v krevním řečišti, minimální interakce s buňkami imunitního systému Extravazace do cílové tkáně Interakce s receptory cílových buněk Endocytoza Únik z endosomu do cytoplasmy Transport k buněčnému jádru Účinná transfekce a produkce aktivního proteinu
74
Systémy pro in vivo dopravu genu
Biodegradovatelné nanočástice Kationtové liposomy Kationtové lipidy (lipoplexy) Interpolyelektrolytové (polykationtové) komplexy DNA (polyplexy) Virální systémy: retroviry, polymerem modifikované rekombinantní adenoviry
75
Interpolyelektrolytové komplexy (IPEC) polykationtů s DNA plasmidy (polyplexy)
76
Tvorba komplexu polykation-DNA
Agregace částic + +/- = 1 : 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Izolované komplexy + + + + +/- > 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/- >> 1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Směs polymeru s komplexem
77
c) Kvarterní ammoniové
Polykationty použité pro přípravu IPEC a) Primární amíny b) Terciární amíny c) Kvarterní ammoniové soli MAEDA MAGEDA MAGGHMDA DMAEM DMAEMam TMAEM TMAEMam a) Primární amíny b) Terciární amíny c) Kvarterní ammoniové soli C H 2 3 O N ( ) 6 C H C H C H 3 3 3 C H C C H C C H C 2 2 2 C O C O C O O O N H ( C H ) ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 2 2 N H 3 C N C H 3 H 3 C N C H 3 H 3 C C H 3 C H C l - C H C l - 3 3 DMAEM DMAEMam TMAEM TMAEMam MAEDA MAGEDA MAGGHMDA
78
Polykationty použitelné pro přípravu IPEC
H C H 2 N H C O H C H 2 C H 2 N H 2 C H 2 C H 2 N H C H 2 C H 2 N A I B N C H 2 C H 2 N H PEI C H 2 C H N H C O H PLL H N C O 2 N a O H C H C H 2 N H 2 PVA
79
Uvnitř buňky při pH < 6 se plasmid uvolní z endosomu
Multifunkční polykationtový vektor pro dopravu genu připravený kondensací DNA s blokovými kopolymery polykationtů a hydrofilních polymerů + + + + + + + + + + plasmid pH 7,4 stabilní při dopravě Fusogení molekula (peptid) Uvnitř buňky při pH < 6 se plasmid uvolní z endosomu Směrující jednotka Hydrolyticky labilní vazba (při pH < 6)
80
Stabilita polykationtového komplexu DNA stabilizovaného hydrofilním PHPMA kopolymerem při inkubaci s DNAzou (fosfátový pufr, pH 7.4, 37 °C)
81
Povrchová úprava IPEC pomocí HPMA kopolymeru, využití pro cílenou dopravu IPEC pomocí aktivních proteinů nebo oligopeptidů NH2 NH2 ONp NH2 NH2 ONp + NH2 ONp NH2 NH2 ONp NH2 NH2 + NH2 ONp NH2 NH protein (IgG, transferin) oligopeptid
82
Průnik do buněk K562 (lidská leukemie) a účinnost transfekce komplexů pLL/DNA (gen kódující ß-Gal). Směrování transferinem. Průnik PL/DNA komplexu do buněk, vliv směrování Účinnost přenosu genu v in vitro podmínkách
83
Virální systémy, rekombinantní adenoviry
84
Adenovir: Potenciální vektor pro nádorovou genovou terapii
Požadavky na intravenozní aplikaci: Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily Nesmí napadat makrofágy a buňky RES Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a komplementem Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách Musí být schopen specifického směrování k vybraným buňkám (retargeting) Receptory: coxsackie a adenovirus receptory (CAR), receptory pro „fibre knob“ ligandy
85
Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou
Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem Reaktivní esterová skupina Aminoskupina + Semitelechelický monovalentní polymer Virus + Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou Modifikovaný virus
86
Osud povrchově modifikovaného viru v cílové buňce
Prostředí v buňce Extracelární prostředí Ochranný polymer adenovirová kapsida Přesměrovaný virus endosom pH < 6 GSH Směrující struktura Uvolnění DNA Degradovatelné vazby Buněčná membrána
87
Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou úpravu virálních nosičů genu
3 C H 3 C H 3 C H 3 C H 2 C C H 2 C C H 2 C C H 2 C C O C O C O C O N H O N H N H C H 2 ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 C H O H C H 3 N C H 3 N H N H C H C l 3 C H 3 C O C O ( C H 2 ) 2 ( C H ) 2 2 Reduktivně štěpitelná vazba (v cytoplasmě) S S S S ( C H ) 2 2 ( C H 2 ) 2 C O C O N EGF S S
88
Množství nemodifikovaných a polymerem modifikovaných virů v krvi po 30 min od aplikace (% vstupní dávky, myši BALB/C) Modifikace viru polymerem a vhodná dávka vede ke snížení poměru počtu virů v játrech vers. krev z poměru >2000 na <1.
89
Asociace s buňkami (FACS) Transgenní exprese genu
Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 – plicní nádor) Polymerem modifikovaný virus Virus retargetovaný pomocí bFGF Nemodifikovaný virus Asociace s buňkami (FACS) Transgenní exprese genu Ad5-GFP
90
Retargeting adenoviru (Ad5-luc) pomocí EGF (epidermální růstový faktor)
Vaginální nádor A431 Ovariální nádor SKOV 3 100 1000 10000 100000 virus pc-virus EGF-pc-virus Luciferase (RLU) 100000 Luciferase (RLU) 10000 1000 100 virus pc-virus EGF-pc-virus
91
Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem
PHPMA modi-fikovaný virus Herceptinem retargetovaný virus Buňky Virus SKOV3 Ovariální nádor K562 Lidská leukemie
92
Závěry Polykationty tvoří dostatečně malé a stabilní komplexy s DNA a plasmidy Stabilitu polykationt/DNA komplexu je možné ovlivňovat strukturou polykationtu a modifikací povrchu komplexu hydrofilním polymerem Účinnost transfekce IPE komplexů může být ovlivňována změnami struktury komplexu a zavedením funkčních molekul (směrování) Modifikace adenoviru hydrofilním HPMA kopolymerem vede k prodloužené cirkulaci viru v krvi a až k 1000 násobné redukci exprese genu (poklesu nespecificke infektivity). Expresi genu je možné obnovit specifickým směrováním polymerem modifikovaného viru pomocí specifických oligopeptidů i proteinů (transferin, herceptin). Specifita směrování virálního vektoru je výrazně závislá na struktuře směrující molekuly IPEC i polymerem modifikované viry jsou slibnými vektory s potenciálním využitím v genové terapii
Podobné prezentace
© 2024 SlidePlayer.cz Inc.
All rights reserved.