Asymetrická Field Flow Frakcionace (AF4)

Prezentace na téma: "Asymetrická Field Flow Frakcionace (AF4)"— Transkript prezentace:

1 Asymetrická Field Flow Frakcionace (AF4)

2 Inventor of FFF 1966 – Invention of Field-Flow Fractionation by Prof. Giddings Field-Flow Fractionation was invented in 1966 by Prof. Calvin Giddings [1] at University of Utah, Salt Lake City, USA. He developed and published the complete theory of Field-Flow Fractionation and was issued several patents in the area. He authored or co-authored more than 400 publications and edited 32 books [2], [3] and was executive editor of the journal “Separation Science and Technology”. He founded the Field-Flow Fractionation Research Center at University of Utah in 1972. Prof. Giddings was twice nominated for the Nobel-Price in 1984 and 1992. In 1986 he founded FFFractionation, the worlds first company which started to commercialize the FFF technology. FFFresearch Center University Utah [1] J.C. Giddings, „New separation concept based on a coupling of concentration and flow non-uniformities“, Sep. Sci., 1, (1966) [2] J.C. Giddings, „Dynamics of Chromatography“, (1965) [3] J.C. Giddings, „Unified Separation Science“, (1992) 2

3 FFF Principle 3

4 Different Separation Forces but Same Separation principle
FFF Methods FFF Family – most important Techniques Different Separation Forces but Same Separation principle

5 FFF Principle - Detail Separation Mechanism Separation Mechanism
Flow Field Thermal Field Sedimentation Field Centrifugal Field

6 FFF Size of Analyte Separation Range / Centrifugal FFF

7 Flow FFF 7

8 Princip AF4

9 Flow FFF: VE ~ 1/D ~ Rh FFF Principle Log M Elution Volume
General FFF Elution order Log M Elution Volume Flow FFF: VE ~ 1/D ~ Rh

10 Carrier-Flow + Focus-Flow = Cross-Flow + Detector-Flow (const.)
AF4 - Steps of Separation 3. Slot-Outlet: 2. Separation and Elution 1. Injection and Focussing Focus off Carrier-Flow (IN) Focus-Flow (IN) Outlet Slot open Diffusion Diffusion Semipermeable Membrane = Cross-Flow (OUT)  Flow IN =  Flow OUT Carrier-Flow + Focus-Flow = Cross-Flow + Detector-Flow (const.)

11 AF4 – Variable Resolution!
“Tailor-made” Separation controlled by cross-flow adjustment PS 3-Mix Increase of Cross-Flow causes better separation Selective enhancement of separation

12 FFF Applications Molar Mass Distributions from AF4-MALLS Mp [kg/mol]
Producer Mp [kg/mol] AF4 -Result 68 77 127 129 246 213 310 313 659 651 1040 907 1260 1321 2750 2691 5000 4623 PS-Standards in THF

13 Separační kanály pro AF4

14 Přístroj Eclipse AFFF od firmy Wyatt

15 Výhody field-flow frakcionace
velký dynamický rozsah – od několika nanometrů až po mikrometrové částice přímý nástřik – minimální příprava vzorku (možno vynechat mnoho časově náročných kroků) rychlá analýza – většinou 10 – 30 minut absence střižných sil separace s vysokým rozlišením (srovnatelné s ultracentrifugací) velmi účinná metoda pro komplexní vzorky interface s moderními analytickými metodami jako MALS, MALDI-TOF atd. možnost sbírat oddělené frakce pro následnou off-line analýzu (elektronová mikroskopie, MS, ELISA atd.)

16 Typická FFF-MALS sestava (Eclipse, DAWN, Optilab, Agilent HPLC)

17 Concentration Detection Light Scattering
FFF Detectors Concentration Detection UV, RI, FLD, IR, QELSD, Light Scattering Low Angle Light Scattering Multi-Angle Light Scattering Dynamic Light Scattering Mass Spectroscopy MALDI TOF ESI TOF ICP-MS

18 Diferenční refraktometr Optilab® rEX
koncentrace analytu v roztoku dn/dc absolutní hodnota indexu lomu roztoku Intenzita světla rozptýleného molekulou je přímo úměrná molekulové hmotnosti monomer: nekoherentní světlo dimer: koherentní světlo

19 DAWN HELEOS MALS detektor
absolutní molekulová hmotnost polymerů a biopolymerů rozsah 103 – 108 D nevyžaduje kalibraci pomocí velikostních standardů 18 samostatných detektorů v úhlech 10° - 160° možnost on-line zapojení úhlová distribuce rozptýleného světla je funkcí druhé mocniny průměru poloměru analytu

20 Diferenční viskozimetr ViscoStar™II
přímé měření specifické viskozity v kombinaci s koncentračním detektorem (např. Optilab rEX) lze vypočítat vnitřní viskozitu v kombinaci s měřením molekulové hmotnosti MALS detektorem poskytuje data pro Mark-Houwinkův graf, z něhož plyne informace o konformaci polymeru a jeho interakci s rozpouštědlem možno definovat hydrodynamický objem a hydrodynamický poloměr

21 Princip citlivého viskosimetrického detektoru
Mark-Houwink-Sakurada

22 Data získaná pomocí mikroviskosimetrického detektoru

23 Frakcionace a velikostní charakterizace solubilisovaných pšeničných gluteninů
Červeně - odezva MALS detektoru (rozptyl světla) při 90° Modře – odezva UV detektoru Černě – průběh velikosti molekulární hmotnosti ve frakcích

24 AF4-MALS-RI frakcionace pěti nativních škrobů z různých zdrojů
AF4-RI fraktogramy a křivky popisující distribuci molekulové hmotnosti pěti vzorků škrobu separace amylózy a amylopektinu výpočet hmotnostního poměru AMY:AMP k určení distribuce molekulové hmotnosti, MW a RZ kanál 18 cm, spacer 350 μm programovaný cross-flow umožnil vysoké rozlišení AMY a AMP absence střižných sil umožňuje separaci bez degradace amylopektinu absence náplně umožňuje separaci bez adsorpce amylopektinu na médium určení molekulových hmotností AMY a AMP bez potřeby kalibrace pomocí standardů

25 Asymmetric Flow FFF AF2000 AT/MT Series - Universal Separator for Proteins, Polymers and Nanoparticles ambient to mid temp Applications Peptides Proteins Antibodies Virus Liposomes Latex Bead Nano Particles Synthetic / natural Polymers 25 25

26 AF2000 HT Series – High Temp Polymer Separator
High Temp Asymmetric Flow FFF AF2000 HT Series – High Temp Polymer Separator Applications Polyolefines Polyethylene Polypropylene PET Polymers 26 26

27 Centrifugal FFF 27

28 Centrifugal FFF - Principle
Separation Principle Centrifugal FFF - Principle Content FFF Principle Systems Applications Summary Gravity Separation Field up to g Size Separation Range: Particles 5 nm – 100 µm Separation based on Size and Density

29 Centrifugal FFF - Design
CF2000 Series Content FFF Principle Systems Applications Summary

30 Splitt FFF 30

31 Sedimentation by gravity Particles 1 – 100µm
SF2000: Separation Gravitational SPLITT FFF - Principle Content FFF Principle Systems Applications Summary Sedimentation by gravity Particles 1 – 100µm Continuous, semi prep (mg/day up to g/day)

32 SF2000 Series - SPLITT Fractionation
Gravitational SPLITT FFF - Design Content FFF Principle Systems Applications Summary