Ing. Pavlína Šobrová Fakulta chemická, VUT v Brně

Prezentace na téma: "Ing. Pavlína Šobrová Fakulta chemická, VUT v Brně"— Transkript prezentace:

1 Ing. Pavlína Šobrová Fakulta chemická, VUT v Brně
Biosenzory Senzory pro monitorování vnějšího prostředí Senzory pro monitorování prostředí v organismu Ing. Pavlína Šobrová Fakulta chemická, VUT v Brně

2 OBSAH Základy Aplikace Shrnutí

3 Biosenzory

4 Definice Sensor - součást zařízení pro snímání fyzikálních veličin. Jde zpravidla o převodníky sledovaných fyzikálních veličin na elektrické napětí nebo elektrický proud pro další zpracování v měřících a řídících systémech, robotech, bezpečnostních zařízeních a podobně [Velký slovník naučný, DIDEROT (1999)]. Biosensor - biologická součást (např. enzym, protilátka) navázaná na elektroanalytické činidlo. Interakcí analytu s biologickou komponentou je generován elektrický signál, který je zesílen a odečten [Velký slovník naučný, DIDEROT (1999)]. Biosensor je analytický přístroj obsahující citlivý prvek biologického původu, který je buď součástí nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje průběžný elektronický signál, který je přímo úměrný koncentraci jedné nebo několika (skupin) chemických látek ve vzorku [Rechnitz G. A. Electroanalysis 3, 73 (1991)].

5 Úskalí definice Co z toho vyplývá?
Představme si skupinu osob osob rozptýlených náhodně po poli, přičemž každá z nich má telefon a hlásí pozorování podmíněná čichem, sluchem, chutí a dotykem. Takový soubor pozorovatelů může poskytovat informace o povaze, intenzitě, prostorovém umístění a časovém průběhu chemických stimulů v daném prostoru. Přitom to bude biosensor - má rekogniční element (lidé) i převodník (telefony). Co z toho vyplývá? Pojem biosensor je: široce použitelný; nemusí popisovat pouze zařízení vyrobená člověkem.

6 Historické milníky Jaroslav Heyrovského objev polarografie v roce 1922. Koncentrace kyslíku v biologických tekutinách pomocí rtuťové kapkové elektrody (Müller a Bamberger, 1935) a spotřeby kyslíku živými organismy (sinice, kvasinky a krevní buňky, Petering a Daniels, 1938). Revoluční změnu těchto sensorů provedl v roce 1956 Leland C. Clark Jr.: předřadil elektrodovému systému membránu propustnou pro plyny, a tak elektrody (pracovní zlatá nebo platinová katoda zatavená ve skle a argentchloridová referentní) fyzikálně isoloval od měřeného prostředí. Tím získal spolehlivý měřící systém vedoucí k mnoha aplikacím a ke zrodu biosensorů.

7 Historické milníky Leland C. Clark Jr.:

8 Historické milníky Clark s Lyonsem poprvé uvedli termín enzymová elektroda (1962). Updike a Hicks propracovali experimentální detaily potřebné k získání funkční enzymové elektrody pro glukózu. První enzymové elektrody se objevují na přelomu 50. a 60. let jako "akademická kuriozita" zprvu provázená nedůvěrou. První komerční biosensor pro glukózu uvedla na trh úspěšně firma Yellow Springs Instrument Company (Ohio) v roce 1975. Objevuje se název biosensor (původně byla snaha použít "bioprobe", tento název však byl chráněn).

9 Historické milníky Lubbers a Opitz zavádí pojem optoda pro sensory na bázi optických vláken (1975). Dalším mezníkem je rok 1982, kdy Schichiri popsal implantovatelný glukosový biosensor – jehlovou enzymovou elektrodu. Koncem 70. let začíná výzkum imunochemických biosensorů (imunosensorů), na počátku současného komerčního úspěchu afinitních biosensorů byla práce Liedberga který navrhnul sledování afinitních interakcí v reálném čase pomocí rezonance povrchových plasmonů ve vrstvě kovu nanesené na optickém rozhraní Dosud nejúspěšnější biosensor je založen na ferrocenu - přenašeči elektronů z oxidoreduktáz na elektrodu.

10 Glukometry

11 Základní pojmy Citlivost: je konečná ustálená změna výstupního signálu biosensoru (S) v důsledku změny koncentrace analytu (c), tj. ΔS/Δc, nebo dS/dc. Při provádění kinetických měření (sleduje se časová změna signálu dS/dt) se citlivost vypočítá jako Δ(dS/dt)/Δc. Někdy se používá transformovaný signál, např. při potenciometrických měřeních ln S. Speciálními druhy signálu mohou být plocha (časový integrál), frekvenční analýza apod. Signál by měl být tak velký, aby šel dobře měřit. V ideálním případě by citlivost měla být konstantní po celou dobu životnosti biosensoru. V reálných systémech se změny citlivosti kompenzují rekalibrací.

12 Základní pojmy Kalibrace: spočívá ve vystavení biosensoru různým standardním roztokům o známé koncentraci analytu. Kalibrační body by měly uzavírat pracovní oblast biosensoru, aby nebylo třeba provádět nespolehlivé extrapolace. Je vhodné použít co nejméně kalibračních bodů, pokud je znám tvar kalibrační závislosti (nejvhodnější je samozřejmě přímka), stačí 1 nebo 2 body. V ideálním případě by stačilo provést kalibraci pouze 1x pro nový biosensor, prakticky je nutné tento proces periodicky opakovat. R2 = – Rostoucí trend R2 = Lineární R2 = – Striktně lineární

13 Základní pojmy Limit detekce (LOD, limit of detection) biosensoru je nejnižší stanovitelná koncentrace analytu. Ideálně je dán rozlišením elektronického měřícího přístroje, obvykle je zhoršován vedlejšími procesy. Signál pozadí, (background) je signál v nepřítomnosti analytu, obvykle se automaticky odečítá od měřeného signálu: S = S(měřený) - S(pozadí). V některých případech je výhodnější použít referentní koncentraci analytu a vůči ní vztáhnout měřený signál. Pro semilogaritmický případ pak dostáváme S/S(ref) = (měření-pozadí)/(reference-pozadí). Obvykle se předpokládá stabilita signálu pozadí, to však v praxi nemusí být pravda (signál pozadí obvykle časem klesá).

14 Základní pojmy Hystereze označuje vliv minulých měření na aktuální signál. Ideálně by měla být nulová. Pozná se ze změny tvaru kalibračních křivek - objevuje se na nich konkávní resp. konvexní prohyb. Důvodem může být to, že vysoká koncentrace analytu může narušit okolí biosensoru nebo prostředí uvnitř biorekogniční vrstvy (nahromadění produktů reakce, lokální změny pH či teploty) a to ovlivní následující měření. Vliv hysterese se může omezit zpomalením měření (je čas na vyrovnání změn). Dlouhodobá stabilita, (drift) je podmíněna změnami citlivosti biosensoru v čase. Citlivost obvykle klesá, ale může přechodně i vzrůst (změna biovrstvy - ztenčení, nabobtnání). Postupný pokles citlivosti může být vyvolán oxidaxí povrchu kovových elektrod, usazováním vrstev proteinů či jiných biomolekul (měření in vivo), otrava biovrstvy těžkými kovy. Skokové změny jsou vyvolány mechanickými vlivy, mohou často uniknout pozornosti. Vždy je proto provádět kontrolu citlivosti a případně provést rekalibraci.

15 Základní pojmy Selektivita (vliv interferencí). Odezva biosensoru by měla být vyvolána pouze přítomností stanovované látky, ostatní látky by se neměly projevit. Prakticky je často nutné rušivé látky eliminovat (zředění, konverse na nerušící sloučeniny, předřazení selektivní bariéry) nebo jejich příspěvek 10 na měřený signál paralelně určit jiným sensorem. Při tomto diferenciální uspořádání se použijí dva stejné převodníky, avšak biorekogniční vrstvou je pokrytý pouze jeden. Druhý slouží jako referentní, lze ho povléct vhodnou indiferentní vrstvou pro vyrovnání difúzních podmínek.

16 Základní pojmy Rychlost odezvy je určována zejména fyzikálními vlastnostmi biosensoru (velikost). Závisí na rychlosti difúze analytu z okolního prostředí k povrchu biosensoru a dále pak vnitřní difúzí uvnitř systému biosensoru. Uplatňují se koncentrace analytu, velikost difúzních koeficientů, délka difúzní dráhy (počet vrstev biosensoru). Z praktického hlediska je výhodné, pokud odezva je limitována difúzí a nikoliv rychlostí bioreakce. Životnost biosensoru je obykle limitována neslabším prvkem, což je biorekogniční část. Přitom je třeba odlišit stabilitu při skladování (shelf life) od operační stability, která může být závislá na počtu a druhu analysovaných vzorků. Pro dlouhodobé uložení biosensoru je obecně vhodná nižší teplota (chladnička, mraznička), z praktického hlediska je pohodlnější skladování v suchém stavu. Optimální podmínky je třeba vždy hledat individuálně.

17 Základní pojmy Biokompatibilita má zvláštní význam pro biomedicínské aplikace (měření in vivo). Při umístění biosensoru přímo v krevním toku je třeba zamezit srážení krve (impregnace heparinem), ve tkáních hrozí nebezpečí zánětlivých reakcí, zajizvení a zarůstání pojivovou tkání. Případná sterilizace biosensoru nesmí negativně ovlivnit jeho aktivitu.

18 Podmínky měření s biosensory
Přímý kontakt se vzorkem. Biosensor se nachází přímo ve sledovaném prostředí (řeka, tkáň, krevní řečiště, fermentor, ...). Přitom by jeho činnost neměla okolní prostředí ovlivnit - vyčerpávání analytu důsledkem měření, ovlivnění toku jiných látek. Při tomto způsobu použití může být užitečné měnit polohu biosensoru, tak lze získat dodatečné informace o distribuci analytu v prostředí a odhalit případné existující koncentrační gradienty. Uzavřená nádoba. Biosensor je umístěn ve vhodné nádobce (často opatřená vodním pláštěm pro temperaci a magnetickým míchadlem). Průtočný systém. Biosensor je umístěn ve vhodné průtočné cele. Jsou možné dva způsoby činnosti. Systémem se nechá střídavě protékat zóna základního roztoku a zóny vzorků.

19 PRINCIP FUNKCE BIOSENSORU
Enzym elektroaktivní substance Peptid elektroda Protein změna pH pH elektroda Elektrický signál Buňka teplo termistor Protilátka světlo foto-dioda DNA piezoelektrické zařízení změna hmoty Mikro- organismus Bioreceptor – biologická část Převodník signálu – fyzikálně chemická část Stanovovaná látka

20 Dělení biosensorů podle biologické (biorekogniční) části
Biokatalytické Biologická složka: enzym, organela, buňka, tkáň, organismus Stanovovaná složka je přeměňována v průběhu chemické reakce; stanovovaná látka obvykle vystupuje jako substrát enzymové reakce. Bioafinitní Biologická složka: lektin, protilátka, nukleová kyselina, receptor. Stanovovaná látka je specificky vázána ve vznikajícím afinitním komplexu.

21 Dělení převodníků Převodníky pro biokatalytické sensory
· Elektochemické systémy (např.: referentní elektrody, pomocné elektrody) · Potenciometrické bioelektrody (např.: ISE) · Amperometrické bioelektrody · Optické (např.: chemiluminiscence, bioluminiscence) Převodníky pro bioafinitní sensory Optické · Piezoelektrické systémy

22 Biosensory na bázi elektrod pro kyslík a peroxid vodíku
Pracovní elektrodou je zlatý nebo platinový drátek (průměr 0.1 až 5 mm dle žádané citlivosti) zatavený ve skle, potenciál pro redukci kyslíku je kolem -650 mV vzhledem k vnitřní Ag/AgCl referentní elektrodě. Klíčovou součástí je membrána propustná pro kyslík. Jako materiál se používá teflon (nejlepší, rychlá odezva, dobrá propustnost pro O2), dále pak polypropylen a polyethylen. Elektrodová redukce kyslíku je čtyřelektronový proces O2 + 2 H2O + 2 e- → H2O2 + 2 OH- H2O2 + 2 e- → 2 OH-

23 Biosensory na bázi elektrod pro kyslík a peroxid vodíku
Sensory jsou použitelné pro biosensory využívající enzymy oxidázy jako biorekogniční element. Tyto enzymy oxidují molekulu substrátu (analytu) za účasti kyslíku, přitom vzniká buď peroxid vodíku nebo voda: Substrát + O2 → Produkt + H2O2 Substrát + O2 → Produkt + H2O První reakce je typická zejména pro oxidasy s flavinovým koenzymem (obvykle žluté barvy, např. glukóza oxidáza, laktát oxidáza), druhý typ převažuje např. u kuproteinů (tyrosináza).

24 Biosensory na bázi elektrod pro kyslík a peroxid vodíku

25 Enzymové biosensory Biokatalytické sensory mají jako rekogniční element enzym - bílkovinu schopnou biokatalyticky přeměnit určitý specifický substrát na produkt. Analyt u enzymových biosensorů vystupuje nejčastěji jako substrát imobilizovaného enzymu. Nejběžnější látkou detekovanou pomocí biosensorů je glukóza. Dále to může být fruktóza, sacharóza, laktóza, škrob, vitamín C, ethanol, kyselina siřičitá (víno).

26 Převodníky pro bioafinitní sensory
Afinitní biosensory využívají jako rekogniční složku biomolekuly schopné specificky vytvářet komplex s analytem, který je strukturně komplementární k vazebnému místu imobilizované biomolekuly. Typickým příkladem je vznik imunokomplexu mezi antigenem a protilátkou nebo hybridizace nukleových kyselin. Mnohem častěji se však ve výzkumné oblasti provádí strukturní studie a studium bioafinitních interakcí (charakterizace protilátek, mapování vazebných míst), poslední dobou také hledání a současná charakterizace biomolekul připravovaných kombinatorickými postupy nebo z genetických knihoven. Protilátky a imunosensory.

27 Receptory a lipidové vrstvy
Receptorové biosensory. Tato oblast chce využít vysoce ciltivé čichové systémy živočichů pro konstrukci umělého nosu (artificial nose). První pokusy se prováděly s čichovými tykadly drobných mořských krabů (crayfish, Callinectus sapidus). Potenciál výstupního nervu se měřil pomocí mikroelektrody a sledovala se frekvence pulsů v závislosti na přitomnosti stimulujících látek. Výstupní frekvence pulsů potenciálu narůstala v přítomnosti stimulujících fyziologických látek (puriny, aminokyseliny, peptidy). Mimo to byl sledován signál na farmaceutické preparáty (léčiva, drogy) a toxické látky.

28 Receptory a lipidové vrstvy
Lipidové vrstvy. Pro mnohé bílkoviny je přirozeným prostředím biomembrána, obsahující hydrofobní zbytky lipidových řetězců. Struktura biomembrány je založena na lipidové dvojvrstvě (BLM, bilayer lipid membrane). Hydrofilní biomolekuly lze na povrchu BLM přichytit pomocí krátké hydrofobní "kotvy", tento princip lze využít i pro jejich imobilizaci. V oblasti biosensorů hrály BLM dlouho méně významnou roli, což souviselo s jejich nízkou stabilitou (několik hodin za běžných podmínek). Poslední dobou se začínají uplatňovat mnohem více, protože se podařilo zlepšit 103 jejich mechanickou stabilitu přípravou na podpůrném povrchu (sBLM, supported BLM). Výhodou je reprodukovatelná příprava, vysoká orientovanost a definovaná tloušťka. Originální koncept biosensoru na bázi lipidové dvojvrstvy byl vyvinut v Austrálii, funguje jako jistý druh převodníku pro sledování interakcí biomolekul.

29 Nukleové kyseliny Biosensory pro detekci nukleových kyselin nebo s nukleovými kyselinami jako biorekogničním elementem byly poměrně dlouhou dobu mimo hlavní oblast zájmu a výrazněji se prosazují až od počátku 90. let. Stimulem rozvoje této oblasti biosensorů bylo hledání rychlejších sekvenačních metod potřebných při celosvětovém projektu sekvenace lidského genomu. V oblasti aplikací se objevila potřeba detekovat mutační poškození důležitých genů, které se projevuje metabolickými poruchami. Potřebnou citlivost biosensory pro detekci DNA získávají díky spojení s polymerázovou řetězovou reakcí.

30 Aplikace biosensorů pro detekci DNA
určování příbuzenských vztahů: HLA komplex, oblast D-smyčky mitochondriální DNA, délkový polymorfismus (VNTR místa). detekce onkogenů a supresorových genů zhoubného bujení: c-myb, c-myc, c-ras, G protein, jun, p53, retinoblastomové geny. dědičné choroby: cystická fibróza, hypercholesterolemie, Huntingtonova choroba, sicklecell anemie, Duchenneova svalová dystrofie, β-thalassemie, polycystická porucha ledvin, hyperchromatosis, hemofilie A, Von Willebrandtova nemoc. viry: cytomegalovirus, lidský papilomový virus, rotaviry (RNA), HIV, lidský virus leukemie T-lymfocytů. bakterie: Mycobacterium tuberculosis, Gonorrhea (RNA, DNA), Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia, Escherichia coli (RNA), Bacillus subtilis (RNA), Bacillus burgdorferi.

31 Využití biosensorů – oblasti Potravinářství a fermentační průmysl
Klinická oblast · největší „pole“ využití pro biosensory; · velmi lukrativní trh, roční objem peněz investovaných do klinických testů již dnes přesahuje 10 mld USD; · konkrétní příklady: osobní glukometry diabetiků; těhotenské testy; stanovení alkoholu atd. Potravinářství a fermentační průmysl · potenciální trh;; konkrétní příklady: systém detekce bakterií. výhledy: sensorické hodnocení potravin („umělý nos“ a „umělý jazyk“); kontrola čerstvosti potravin.

32 Využití biosensorů – oblasti
Vojenská a bezpečnostní oblast · velký zájem ze strany armád různých zemí; konkrétní příklady: detektor NAIAD, který elektrochemicky detekuje aktivitu cholinesterázy – slouží pro detekci nervově paralytických sloučenin jako jsou sarin a soman; výhledy: detekce výbušnin; detekce drog při celních kontrolách; detekce chemických a biologických zbraní. Bioafinitní systémy pro výzkum detekce širokého spektra látek od peptidů, proteinů a léčiv, přes nukleové kyseliny až po samotné prvky jakou jsou těžké kovy.

33 Praktické aplikace Těžké kovy

34 TĚŽKÉ KOVY Prvky s hustotou vyšší než 5 g.cm-3.
Dělíme je na esenciální a toxické. Esenciální vlastnosti: součásti biologicky významných látek (např. zinkové prsty), katalyzátory atd. Toxické vlastnosti: narušení životně důležitých biochemických cest, soupeření s esenciálními kovy smrt organismu. esenciální kov toxický kov 2

35 Studovat interakci cisplatiny s DNA
CÍLE PRÁCE Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kademnatých a zinečnatých iontů Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kademnatých a zinečnatých iontů, a cisplatiny Studovat interakci cisplatiny s DNA 3

36 Studovat interakci cisplatiny s DNA
CÍLE PRÁCE Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia a zinku Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Studovat interakci cisplatiny s DNA 4

37 Fytochelatin – rostlinný peptid
I. Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Fytochelatin – rostlinný peptid Významný rostlinný peptid, který má základní strukturu (g-Glu-Cys)n-Gly. Dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu (g-Glu-Cys) se může opakovat 2 až 11krát. Molekula glutathionu (γ-Glu-Cys-Gly) je substrátem pro syntézu fytochelatinů. Hlavní funkce této skupiny peptidů je detoxikace těžkých kovů, která probíhá vazbou na thiolové skupiny peptidu schopnost interakce. C HN H CH2 HOOC O NH CH2SH COOH n (g-glutamylcysteinyl)n glycin 5

38 adsorpce fytochelatinu elektrochemická detekce
I. Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Modifikace elektrody 1 omytí elektrody 3 fytochelatin 2 adsorpce fytochelatinu elektrochemická detekce 4 500 μM PC2 – – – –0.3 Potenciál (V) 2 nA PC2 obnovení povrchu 1 mM Výška píku (nA) 10 μM Doba akumulace (s) Převzato z Adam, V.; et.al. Phytochelatin modified electrode surface as a sensitive heavy metal ions biosensor. Sensors. 2005, 5, 6

39 Studovat interakci cisplatiny s DNA
CÍLE PRÁCE Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia a zinku Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Studovat interakci cisplatiny s DNA 7

40 Konstrukce biosensoru
I. Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Konstrukce biosensoru těžký kov PC2 interakce s těžkým kovem 4 omytí elektrody 5 1 3 elektrochemická detekce 6 voltamogram PC2 2 adsorpce PC2 Převzato z Adam, V.; et.al. Phytochelatin modified electrode surface as a sensitive heavy metal ions biosensor. Sensors. 2005, 5, 8

41 Stanovení zinku a kadmia pomocí navrženého biosensoru
II. Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia a zinku Stanovení zinku a kadmia pomocí navrženého biosensoru KADMIUM 1 mM PC mM Cd(II) PC2(Cd) 1 mM PC2 bez Cd(II) PC2 l, u Výška píku (nA) p Výška píku (pA) CdPC2 0.5 nA CdPC2 PC2 PC2(Cd) – – – –0.3 Potenciál (V) Koncentrace kadmia (mM) ZINEK 1 mM PC2 bez Zn(II) PC2 1 mM PC mM Zn(II) PC2 p Výška píku (nA) u Výška píku (pA) 0.5 nA ZnPC2 ZnPC2 – – – – 0.3 Potenciál (V) Koncentrace zinku (mM) Převzato z Adam, V.; et.al. Phytochelatin modified electrode surface as a sensitive heavy metal ions biosensor. Sensors. 2005, 5, 9

42 Studovat interakci cisplatiny s DNA
CÍLE PRÁCE Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia a zinku Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Studovat interakci cisplatiny s DNA 10

43 Metalothionein – protein
III. Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Metalothionein – protein Intracelulární, nízkomolekulární, na cystein velmi bohatý protein (6 – 10 kDa). Metallothionein se skládá ze dvou vazebných domén – α a β. N-terminální část peptidu – β-doména; tři vazebná místa pro dvojmocné ionty. C-terminální část peptidu – -doména; čtyři vazebná místa pro dvojmocné ionty kovů. Nejčastější repetice: cystein(C)–serin(S)–cystein(C). Počet aminokyselin Aminokyseliny (C – cystein, S – serin, K – lysin, G – glycin, A – alanin, T – threonin, N – asparagin, E – kyselina glutamová, M – methionin, P – prolin, D – kyselina asparagová, Q – glutamin, I – isoleucin) Převzato z Cobine, M.A.; et.al. Solution structure of Cu6 metallothionein from the fungus Neurospora crassa. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 11

44 adsorpce metalothioneinu elektrochemická detekce
III. Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Modifikace elektrody 1 omytí elektrody 3 metalothionein 2 adsorpce metalothioneinu elektrochemická detekce 4 obnovení povrchu Převzato z Adam, V.; et.al. Study of metallothionein modified electrode surface behaviour…. Electroanalysis. 2005, 17, 12

45 Modifikace elektrody Voltamogramy MT Adsorpce MT
III. Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Modifikace elektrody Voltamogramy MT Adsorpce MT 10 mM MT bez 1 mM TCEP CdT CdT 10 nA CdT` scan MT(Zn) mM MT(Cd) ZnT` mM ZnT Výška píku (nA) nM – – – – 0.3 Potenciál (V) ZnT CdT MT(Zn) Potenciál (V) MT(Cd) ZnT` 10 mM MT s 1 mM TCEP 10 nA scan – – – – 0.3 Doba akumulace (s) Převzato z Adam, V.; et.al. Study of metallothionein modified electrode surface behaviour…. Electroanalysis. 2005, 17, 13

46 Konstrukce biosensoru
III. Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Konstrukce biosensoru těžký kov MT interakce s těžkým kovem 4 omytí elektrody 5 1 3 elektrochemická detekce 6 voltamogram MT 2 adsorpce MT Převzato z Adam, V.; et.al. Study of metallothionein modified electrode surface behaviour…. Electroanalysis. 2005, 17, 14

47 Studovat interakci cisplatiny s DNA
CÍLE PRÁCE Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia a zinku Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Studovat interakci cisplatiny s DNA 15

48 Vliv těžkého kovu na signály MT
IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Vliv těžkého kovu na signály MT KADMIUM 10 mM Cd(II) 1000 mM Cd(II) 50 mM Cd(II) 100 mM Cd(II) 250 mM Cd(II) 500 mM Cd(II) CdT CdT 5 nA Výška píku (nA) MT(Cd) MT(Cd) CdT´ CdT’ MT(Zn) Koncentrace kadmia (mM) ZINEK CdT CdT 5 nA 10 mM Zn(II) 500 mM Zn(II) 1000 mM Zn(II) MT(Zn) p Výška píku (nA) l, p Výška píku (nA) MT(Zn) ZnT ZnT – – – – 0.3 Potenciál (V) Koncentrace zinku (mM) Převzato z Adam, V.; et.al. Study of metallothionein modified electrode surface behaviour…. Electroanalysis. 2005, 17, 16

49 Lidská moč Lidské krevní sérum
IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Lidská moč Lidské krevní sérum MT bez Cd(II) CdT MT(Zn) MT(Cd) MT mM Cd(II) – 0.46 V – 0.39 V CdT’ – – – – 0.3 Potenciál (V) 5 nA CdT MT bez Cd(II) MT mM Cd(II) CdT’ MT(Cd) MT(Zn) 5 nA – – – – 0.3 Potenciál (V) CdT CdT CdT CdT Výška píku (nA) Výška píku (nA) Výška píku (nA) Výška píku (nA) Cd Zn Cd Zn Koncentrace Cd(II) (mM) Koncentrace Zn(II) (mM) Koncentrace Cd(II) (mM) Koncentrace Zn(II) (mM) Převzato z Adam, V.; et.al. Study of metallothionein modified electrode surface behaviour…. Electroanalysis. 2005, 17, 17

50 IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny
Porovnání MT biosensoru s metodou diferenční pulsní anodickou rozpouštěcí voltametrií při detekci Zn(II) y = (±0.0296)x – (±1.6699) R2 = Výška signálu MT(Zn) (nA) MT Biosensor Koncentrace Zn(II) (µM) y = (±0.0174) R2 = Výška signálu (nA) Koncentrace Zn(II) (µM) Diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie Převzato z Adam, V.; et.al. Study of metallothionein modified electrode surface behaviour…. Electroanalysis. 2005, 17, 18

51 Detekce cisplatiny pomocí navrženého biosensoru
IV. Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Detekce cisplatiny pomocí navrženého biosensoru Chlorid sodný (0.5 M) – 1.11 V 370 mM 0.5 nA CdT 10 mM MT mM cisplatiny 5 nA PtMT – – – –0.3 Potenciál (V) CdT p Výška píku (nA)  Výška píku (nA) PtMT Koncentrace cisplatiny (mM) Převzato z Petrlova, J.; Potesil, D.; Zehnalek, J.; Sures, B.; Adam, V.; et.al. Cisplatin electrochemical biosensor. Electrochim. Acta 2006, in press. 19

52 Studovat interakci cisplatiny s DNA
CÍLE PRÁCE Ověřit možnost modifikace rtuťové elektrody biologicky aktivním peptidem – fytochelatinem Fytochelatinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia a zinku Využít kovy vázající protein metalothionein jako další biologickou složku biosensoru Metalothioneinem modifikovanou elektrodu aplikovat pro detekci kadmia, zinku a cisplatiny Studovat interakci cisplatiny s DNA 20

53 V. Studovat interakci cisplatiny s DNA Tvorba aduktů cisplatiny s DNA
Cisplatina Jaderná obálka Deoxyribosa Báze Fosfát Reakce s celulárními thioly (GSH a MT), RNA, mitochondriální DNA Adukty uvnitř jednoho vlákna Mono-adukt Mezivláknový adukt Převzato z Kartalou, M.; Essigmann, J.M. Recognition of cisplatin adducts by cellular proteins. Mutat. Res-Fund. Mol. M. 2001, 478, 1-21. 21

54 V. Studovat interakci cisplatiny s DNA Tvorba aduktů cisplatiny s DNA
100 mM Cl- 4 mM Cl- Převzato z Ericson, A.: "Model systems for metal-DNA interactions". Lund, Sweden: Lund University, 1997, pp. 225. 22

55 Studium interakce cisplatiny s DNA
V. Studovat interakci cisplatiny s DNA Studium interakce cisplatiny s DNA Detekce DNA pomocí cyklické voltametrie DNA bez přídavku cisplatiny DNA s cisplatinou G pík Změna píku G a b c scan Guanin Výška píku (pA) d 50 nA 100 nA CA pík – – – – –0.15 Potenciál (V) Potenciál (V) Koncentrace cisplatiny (mM) 24

56 Studium interakce cisplatiny s DNA
V. Studovat interakci cisplatiny s DNA Studium interakce cisplatiny s DNA 24 hodin Pt(II)DNA adukt Pt(II) komplex DNA + Ultrafiltrace Změny G pík – cyklická voltametrie Změny CdT píku – biosensor Detekce of Pt- DNA aduktů a CdT CdT Změna G pík Výška píku (pA) Výška píku (nA) Výška píku (nA) Výška píku (%) Koncentrace Pt(II)-DNA aduktu (μg/mL) Čas interakce (min) Koncentrace Pt(II)-DNA aduktu (μg/mL) 25

57 Praktické aplikace Mikroorganismy

58 1. Automatizovaná izolace bakterií S. aureus
Cíle 1. Automatizovaná izolace bakterií S. aureus 2. Automatizovaná izolace zinkových proteinů S. aureus 3. Elektrochemické stanovení zinku z bakteriálních proteinů 4. Elektroforéza SDS - PAGE

59 Příprava mikroorganismu, základní charakteristika růstu při interakci se zinečnatými ionty
Staphylococcus aureus Přeočkování Kultivace 37 °C, zákal 0,1 λ=600nm Přídavek ZnCl2, ZnSO4, Zn(NO3)2 Fotometrické měření růstových křivek (λ = 600nm)

60 Automatická izolace bakteriálních buněk a zinkových proteinů pomocí MPs
Fáze І.: Izolace bakterií Staphylococus aureus pomocí MPs modifikovaných IgG Fáze ІІ.: Uvolnění proteinů z bakterií S. aureus, které se navázaly na povrch MPs pomocí ultrazvuku Fáze ІІІ.: Následná izolace Zn proteinů pomocí MPs s navázanými IgY proti Zn + Zn + ultrazvuk ostatní proteiny a části buněk + Zn Protein A - S. aureus Zn Paramagnetická částice Staphylococcus aureus IgG Působení ultrazvuku IgY (gal) proti Zn Zn protein původem z S. aureus

61 Výsledky Ověření imobilizace IgG na MPs Ověření imobilizace IgY na MPs
Kalibrační křivka zinku -1.10 -1.00 -0.90 Potencial (V) 250 nA Výška píku (nA) Koncentrace Zn2+ (μg·ml-1) bez MPs s MPs po MPs Růst buněk S. aureus MPs Stanovení zinku v buňkách S. aureus (počet buněk*103)

62 Elektroforetická detekce mikrobiálních proteinů
Ověření izolace proteinů pomocí MPs z lyzátu kDa Mr (počet buněk*103) 50 75 100 150 250 37 25 20 kDa Mr R L 15 250 150 100 75 50 37 25 20 15 R – retentát L – bakteriální lyzát Western blotting pomocí sekundární protilátky Bilance zinku 50 75 37 25 20 15 kDa Mr Eluát Protilátky Velká podjednotka slepičí IgY Fab fragment Malá podjednotka slepičí IgY

63 Závěr Podařilo se nám vyvinout rychlou a automatizovanou metodu pro izolaci bakterií a izolaci zinkových proteinů uvolněných z těchto bakterií. Pomocí paramagnetických mikročástic dokážeme izolovat S. aureus v množství menším, než 100 buněk v 1 ml vzorku. Imunoextrakce zinkových proteinů z izolovaných bakterií s výtěžkem dostatečným pro proteomickou analýzu. Do budoucna proteomická analýza bakteriálních proteinů, které způsobují jejich rezistenci.

64 Shrnutí Miniaturizace Osobní přístroje Nízká cena

65 Literatura: A.J. Bard, L.R. Faulkner : Electrochemical Methods, John Wiley and Sons, New York 1980 J. Zýka a kolektív : Analytická příručka, I. díl, SNTL/ALFA, Praha 1979 Z. Galus : Teoretičeskije osnovy elektrochimičeskogo analiza, Izd. Mir, Moskva 1974 P. Skladal, Biosensory, Brno, 2002 J. Wang : Analytical Electrochemistry, VCH Publ., New York 1994

66 Děkuji vám za vaši pozornost a přeji vám krásný zbytek dne