Metabolismus pojiva plicních cév při chronické hypoxii Jana Novotná

Plicní hypertenze (PH) je syndrom charakterizovaný zvýšením středního tlaku v plicnici. Alveolární hypoxie způsobuje zúžení cév plicního řečiště a následuje hypertrofie médie a vaskularizace plicních arteriol, což vede k trvalému zvýšení plicního arteriálního tlaku. Remodelace (přestavba) cévní stěny v periferním plicním řečišti je významným patogenetickým mechanismem vzniku všech forem plicní hypertenze. K remodelaci dochází jak při pobytu na vysokých horách, tak u vrozených nebo získaných srdečních chorob (plicní arteriální hypertenze, kardiovaskulární a plicní onemocnění, stavy spojené s hypoxií).

CHRONICKÁ HYPOXIE PŮSOBÍ PLICNÍ HYPERTENZI

Experimentální model hypoxické plicní hypertenze Plicní hypertenze (PH) vyvolaná chronickou hypoxií u potkanů je jedním z nejčastěji používaných zvířecích modelů PH. Normobarická hypoxická komora, 10% O2

Periferní plicní cévy při chronické hypoxické plicní hypertenzi Normoxie Chronická hypoxie Proliferace hladkých sval. buněk Fibróza Vazokonstrikce

Přestavba a rekonstrukce pojivové tkáně při chronické hypoxické plicní hypertenzi Syntéza kolagenu a elastinu Proliferace hladkého svalu Poddajnost cévní stěny Poškození - uvolněné radikálové sloučeniny ROS NO peroxinitrit aktivace MMPs

HYPOTÉZA mechanismu remodelace stěny periferních plicních cév Hypoxie Tkáňové poškození Zvýšená kolagenolytická aktivita Štěpy kolagenu Aktivace mesenchymových buněk Rekonstrukce periferních plicních cév Plicní hypertenze

Vypracování techniky izolace periferních plicních cév potkana

Preparace periferních plicních cév III. – V. řádu

Analýza kolagenu izolovaného z periferních plicních cév potkanů vystavených dlouhodobé hypoxii

Extrakce nekolagenních bílkovin. Extrakce kolagenní frakce limitovanou pepsinizací. Analýza kolagenu SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou a pomocí imunoblotovací techniky. Analýza extraktů kolagenolytických enzymů pomocí zymografie.

Rozdělení kolagenních peptidů pomocí SDS gelové elektroforézy X1 X2 Novotná a spol., Life Sci 1998

Kolagenáza štěpí kolagen mezi 775 – 776 AK zbytky (Gly – Ile/Leu)

Relativní densita peptidů kolagenních frakcí

Aktivita kolagenolytických matrixových metaloproteináz stanovená v extraktech z celé plicní tkáně pomocí zymografie na želatině kDa 97.4 62.2 45 ProMMP-9 MMP-9 ProMMP-2 MMP-2 ProMMP-13 N CH MMP9 – želatináza B MMP2 – želatináza A MMP13 – kolagenáza potkana

Je hypoxií vyvolaná kolagenolytická aktivita prokazatelná v časné fázi expozice hypoxii?

Elektroforetický profil kolagenní frakce izolované z periferních plicních cév potkanů vystavených hypoxii 4 dny

Imunoblot kolagenní frakce extrahované z periferních plicních cév potkanů vystavených hypoxii 4 dny a potkanů normoxických.

Aktivita kolagenázy - matrixové metaloproteinázy MMP-13, stanovená v extraktech z celé plicní tkáně pomocí imunoblotu ProMMP-13 MMP-13

Hypoxie aktivuje v periferních plicních cévách a v plicní tkáni matrixové metaloproteinázy, vzniknou štěpy kolagenu, štěpy kolagenu stimulují růst buněk hladkého svalu.

Vliv fragmentovaného kolagenu na proliferaci hladkého svalu „in vitro“ 3000 fragmentovaný kolagen É 2500 2000 Denzita buněčné populace 1500 J É J 1000 É J 500 J É 1 2 3 Dny pokusu Bačáková a spol., EMP 2001

Inhibice aktivity MMPs specifickým inhibitorem

Použití syntetického inhibitoru MMPs Hypoxie Tkáňové poškození Zvýšení kolagenolytické aktivity Štěpy kolagenu Aktivace mesenchymových buněk Rekonstrukce cévní stěny Plicní hypertenze INHIBICE KOLAGENOLÝZY (BATIMASTAT, BB94)

Nízkomolekulární štěpy kolagenu typické pro periferní plicní cévy zvířat vystavených hypoxii nebyly po podání batimastatu přítomny g KDa b 212 170 a1 (I) a2 (I) 116 76 Kol (I) N H N+B H+B 53 Herget a spol., AJP 2003

Nízkomolekulární štěpy kolagenu (m. h Nízkomolekulární štěpy kolagenu (m.h. 76 kD), typické pro periferní plicní cévy zvířat vystavených hypoxii, po podání batimastatu téměř vymizely p<0.02 3 2.5 2 Relativní optická hustota v gelu [%] 1.5 1 0.5 Batimastat Batimastat NORMOXIE HYPOXIE Herget a spol., AJP 2003

Batimastat inhibuje zvýšení tlaku v plícnici (PAP) při chronické hypoxii * p < 0. 02 * + PAP (mmHg) 35 30 + 25 20 15 10 5 Batimastat Batimastat Normoxie Hypoxie Herget a spol., AJP 2003

Počet muskularizovaných distálních plicních cév u potkanů vystavených hypoxii byl po podání batimastatu snížen p<0. 01 % DL 45 40 35 30 25 20 15 10 5 Batimastat Batimastat Normoxie Hypoxie Herget a spol., AJP 2003

Hypoxické poškození superoxid NO Peroxynitrit (nitrotyrosin)

Hypoxické poškození superoxid NO Peroxynitrit CO2 (nitrotyrosin) Hyperkapnie

CO2 jako antioxidant . NO + O2- O=N-OO- O=N-OO-C=O O- CO2 CO32- + +NO2 peroxinitrit nitrosokarbonátový aniont CO2 CO32- + +NO2

Hyperkapnie brání plasmatickému zvýšení nitrotyrosinu při chronické hypoxii Normoxie Hypoxie 5d Hypoxie + CO2 5d 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Nitrotyrosin [nM] P < 0.001 P < 0.03

Hyperkapnie brání rozvoji hypoxické plicní hypertenze Normoxie Hypoxie Hypoxie + CO2 5 10 15 20 25 30 Pulmonary arterial mean BP [torr] P < 0.001 P < 0.01

Hyperkapnie brání vzniku nízkomolekulárních štěpů kolagenu

HYPOXIA 4 DAYS Elektroforéza kolagenní frakce z periferních plicních cév potkanů v hypoxii 4 dny 1 2 3 4 5 6 7 Kol I g b a1 a2 1A 2A 1B 2B Jednotlivá hypoxická zvířata

Elektroforéza kolagenní frakce z periferních plicních cév potkanů v hypoxii 4 dny + CO2 HYPOXIA + HYPERCAPNIA g b a1 a2 Kol I 1 2 3 4 5 6 7 Jednotlivá zvířata v hypoxii s hyperkapnií

Závěr Rekonstrukce periferních plicních cév při hypoxické plicní hypertenzi souvisí se zvýšenou kolagenolytickou aktivitou v jejich stěně. Omezení kolagenolytické aktivity brání rozvoji hypoxické plicní hypertenze. Naše výsledky nás vedou k závěru, že mechanismem vedoucím ke zvýšení aktivity matrixových metaloproteinas je radikálové tkáňové poškození. (Herget a spol., Phys. Res. 2000)