Vliv opakovaného podání metamfetaminu a metanandamidu na expresi DRD1, DRD2 a CB1 receptorů v myším mesencefalu Michal Jurajda, Leoš Landa Seminář Ústavu patologické fyziologie LF MU

Studie ve kterých jsou hodnoceny účinky na pozorovatelné aktivity, odpovědi nebo preference u zvířat, včetně rozlišovacích pokusů. BEHAVIORÁLNÍ FARMAKOLOGIE použití zvířecích modelů

živý organismus, jehož studium podle určitých pravidel dovoluje reprodukovat a analogicky odvozovat chování a fenomény vyskytující se u člověka nebo dalších živočišných druhů. definice zahrnuje modely určené pro studium fyziologických i patologických procesů a zákonitostí Zvířecí model Nejrozšířenější metody zvířecích modelů závislostí zaměřeny na schopnost návykových látek přímo ovlivnit chování zvířat

definice závislosti je zde formulována jako behaviorální vzorec kompulzivního užívání drog, charakterizovaný nepřekonatelnou potřebou -užívat drogu - zajišťovat její přísun - velkou tendencí k relapsu při abstinenci (Jaffe, 1975)

Zvířecí modely závislostí (rozdělení): Modely založené na pozitivní posilovací vlastnosti drogy Modely averzivních vlastností po vysazení drogy Operantní autoaplikace (self-administrace) Odměna vyvolaná stimulací mozku Preference místa „Drug discrimination“ (rozpoznání, rozlišení drogy) Operantní autoaplikace (self-administrace) u zvířat drogově závislých Averze k místu

Modely založené na pozitivní posilovací vlastnosti drogy Operantní autoaplikace (self-administrace – i.v., p.o.) zneužívané látky jsou zvířaty snadno autoaplikovány látky, které jsou ochotně autoaplikovány korespondují s látkami majícími vysoký návykový potenciál tento vztah je tak silný, že je autoaplikace považována za prediktivní model návykového potenciálu látky

vodič s katétrem infúzní pumpa „neaktivní otvor“ „aktivní otvor“ katétr PC

Vztah mezi endokanabinoidním systémem a metamfetaminovými mechanizmy v mozku další experimenty s využitím jiných animálních modelů Times Cited: 38

METAMFETAMIN Endokanabinoidní systém CB receptory + endogenní ligandy CB 1 receptory (CNS) CB 2 receptory (buňky imunitního systému) anandamid 2-arachidonoyl glycerol noladin éter syntetická forma METANANDAMID Nepřímé sympatomimetikum (uvolňuje DA a NA, psychostimulans) Metanandamid a metamfetamin

zvýšení odpovědi po opakované aplikaci látky (většinou behaviorální:lokomoce, stereotypní pohyby) snížená odpověď na účinky látky, která musí být pro dosažení stejného efektu podávána ve stále vyšších dávkách podmínkou je intermitentní podávání látky látka je většinou podávána v kratších intervalech či kontinuálně Uplatnění při závislosti na psychotropní látky (při odvykání stačí k vyvolání účinků menší množství drogy) Tolerance Tolerance Senzitizace Senzitizace (Robinson & Berridge, 1993) Látky vyvolávající závislost

Behaviorální senzitizace rozvoj exprese

Zkřížená senzitizace = zvýšená odpověď na testovanou látku může být vyvolána předchozí opakovanou aplikací odlišné látky než je látka testovaná Příklady zkřížené senzitizace: tetrahydrokanabinolem k morfinu (Cadoni et al., 2001) tetrahydrokanabinolem k heroinu (Lamarque et al., 2001 Příklady senzitizace: amfetamin (Costa et al., 2001) kokain (Elliot, 2002) opiody (De Vries et al., 1999) kanabinoidy (Cadoni et al., 2001)

Vliv ligandů kanabinoidních receptorů na senzitizaci k účinkům metamfetaminu na lokomoci u myší Přístroj pro snímání motorické a explorační aktivity zvířat „Actitrack“ (Panlab s. l., Španělsko)

uběhnutá vzdálenost tvar trajektorie doba strávená rychlým pohybem doba strávenou bez pohybu panáčkování Příklady měřených parametrů v testu otevřeného pole vhodné pro testování účinku psychostimulačně působících látek, protože jejich aplikace se jasně projeví na zmíněných lokomočních prvcích chování

Rozdělení plochy na jednotlivé oblasti

Typické trajektorie v jednotlivých skupinách Naivní myš Myš po 1. aplikaci metamfetaminu Senzitizovaná myš

Pomocí tohoto modelu se nám podařilo prokázat: rozvoj zkřížené behaviorální senzitizace k psychostimulační látce metamfetaminu po předchozí opakované aplikaci agonisty kanabinoidních CB1 receptorů metanandamidu potlačení tohoto fenoménu po předchozí opakované společné aplikaci metamfetaminu a antagonisty kanabinoidních CB1 receptorů, látky AM 251 Landa, L., Šlais, K., Šulcová A. Involvement of cannabinoid CB1 and CB2 receptor activity in the development of behavioural sensitization to methamphetamine effects in mice. Neuroendocrinology Letters 2006; 27: 63-69

V1 V2 M C MM CM

Relativní exprese Relativní exprese jednotlivých druhů receptorů v myším mesencefalu byly stanoveny na úrovni mRNA pomocí real time PCR. Byla použita technologie TaqMan sond Exprese byla vztažena k expresi Gapdh

Relativní exprese Experimentální zvířata byla usmrcena „přetržením vazu“ Mozek byl okamžitě vypreparován z kalvy opláchnut ve fyziologickém roztoku a po přetětí v sagitální rovině stabilizován v patřičném množství RNAlater

Relativní exprese Izolace celkové RNA byla provedena pomocí kitu RNAeasy mini (Qiagen) Reverzní transkripce byla provedena pomocí kitu Omniscript (Qiagen) s použitím oligo dT primerů

Relativní exprese CB1 receptoru v 1. větvi experimentu V M MM 0,03

Relativní exprese CB1 receptoru v 2. větvi experimentu V CM C 0,03 0,003 0,0008

Relativní exprese D1 receptoru v 1. větvi experimentu V M MM 0,0008

Relativní exprese D1 receptoru v 2. větvi experimentu V CM C 0,03 0,02

Relativní exprese D2 receptoru v 1. větvi experimentu V M MM

Relativní exprese D2 receptoru v 2. větvi experimentu V CM C

ZÁVĚRY I (behaviorální část experimentu) 1) Znovu bylo potvrzeno, že opakovaná aplikace metamfetaminu vyvolá behaviorální senzitizaci k jeho stimulačním účinkům 2) Stimulace kanabinoidních CB 1 receptorů agonistou metanandamidem vedla ke vzniku zkřížené senzitizace k metamfetaminu

ZÁVĚRY II - PCR část experimentu (CB1 receptory) 3) Výsledky studie pomocí real time PCR ukázaly signifikantně zvýšenou expresi CB1 mRNA po poslední dávce opakovaných aplikací Met (tzn. u senzitizovaných zvířat). 4) Zvýšení exprese CB1 mRNA po první dávce metanandamidu, které bylo následováno snížením exprese CB1 mRNA po provokující dávce metamfetaminu (tzn. u zkříženě senzitizovaných zvířat).

ZÁVĚRY III - PCR část experimentu D1 receptory 5) Zvýšení exprese D1 mRNA po poslední dávce opakovaných aplikací Met (tzn. u senzitizovaných zvířat).. 6) Zvýšení exprese D1 mRNA po první dávce metanandamidu, které bylo následováno nesignifikantním snížením exprese CB1 mRNA po provokující dávce metamfetaminu (tzn. u zkříženě senzitizovaných zvířat).

ZÁVĚRY IV - PCR část experimentu D2 receptory 7) Změny v expresi D2 mRNA nebyly signifikantní vůbec mezi žádnými skupinami ani u zvířat senzitizovaných ani u zvířat zkříženě senzitizivaných k účinkům Met.

ZÁVĚRY V (PCR část experimentu) Uvedené výsledky naznačují, že podání metamfetaminu a metanandamidu může vyvolat změny na genomové úrovni, které jsou zřejmě zapojeny v senzitizačních procesech, přinejmenším v neuronech středního mozku myší u senzitizovaných zvířat. Existující údaje o roli dopaminových D1 a D2 receptorů nebo jejich interakcí v procesech "posilujícího" účinku ("reinforcement") látek problematiku zcela neobjasňují a jsou dosti protichůdné (Ikemoto et al., 1997; Bratcher et al., 2005; Kleinman et al. 2006). Naše prezentované výsledky naznačují, přinejmenším na genomové úrovni, zapojení CB1 receptorů a D1 receptorů, nikoli však D2 receptorů v podmínkách behaviorální senzitizace k metamfetaminu a zkřížené senzitizace metanandamidem k metamfetaminu.

VÝSTUPY: Landa, L., Jurajda, M. Behavioural sensitization to methamphetamine affects expression of cannabinoid CB1 receptors in mouse midbrain. Behavioural Pharmacology 2007, 18, Suppl. 1, S27-S28 Landa, L., Jurajda, M. Acute and repeated exposure to methamphetamine changes expression of CB1 receptor in mesencephalon of the mouse brain. European Neuropsychopharmacology 2007, 17, Suppl. 4, S557 Landa, L., Jurajda, M. Stanovení exprese genu pro kanabinoidní CB1 receptor pomocí real time PCR v myším mesencephalonu po senzitizaci metamfetaminem. Psychiatrie, 2008, Suppl. 1, 45 Landa, L., Jurajda, M. Akutní a opakovaná aplikace metamfetaminu ovlivňuje expresi genů pro kanabinoidní CB1 receptor a dopaminový D1 receptor v myším mezencefalu. In: Quo vadis, psychiatria?, Galén, 2008, Landa, L., Jurajda, M.Behavioural sensitization to methamphetamine affects expression of dopamine D1 receptors in mouse midbrain. The International Journal of Neuropsychopharmacology, 2008, Vol. 11, Suppl. 1, 234 Landa, L., Jurajda, M. Repeated exposure to methamphetamine and methanandamide changes relative expression of D1 receptor in mouse midbrain. European Neuropsychopharmacology, 2008, 18, Suppl. 4, S542 – S543 Landa, L., Jurajda, M. Repeated methamphetamine administration changes the relative expression of D1 receptor but not of D2 receptor in mouse midbrain. In: Abstracts of Regional CINP Congress, Bratislava, 27. – 30. November, 2008, 41 Landa, L., Jurajda, M. Exprese genů pro dopaminové D1, 2 receptory v myším mesencephalonu po zkřížené senzitizaci kanabinoidem k metamfetaminu. Psychiatrie, 2009, Suppl. 1, 48

Děkujeme za pozornost