MiRNA 1.12.2009.

Prezentace na téma: "MiRNA 1.12.2009."— Transkript prezentace:

1 miRNA

2 miRNA Kompletace projektu Human Genome v roce potvrdila hypotézu, že velká část genomu není přeložena do bílkovin. Tato tzv. “junk” DNA se považovala za evoluční debris bez zvláštní funkce. Nyní je známo, že část této DNA je velmi relevantní v regulaci genové exprese. Zatím bylo identifikováno asi 1000 lidských sekvencí miRNA, z nichž každá má možnost stovek mRNA cílů. Zatím je význam této molekuly DNA podceněn vzhledem k tomu, že funkce miRNA se projevuje prakticky ve všech biologických procesech včetně rakovin, regulace kmenových buněk, imunitních funkcí, neurogeneze, metabolismu a mnohých jiných. Expresní vzorce miRNA se považují za novou třídu biomarkerů pro fenotypy onemocnění a tkáňové klasifikace s větším predikčním potenciálem, než mají biomarkery v kódujících sekvencích.

3 miRNA Zralé microRNA (miRNA) jsou malé jednořetězcové molekuly RNA, typicky s 22 nukleotidy. Poprvé byly identifikovány u organismu Caenorhabditis elegans v roce 1993, dosud identifikovány u mnoha druhů živočichů i rostlin. Tyto typy RNA jsou původně transkribovány jako větší RNA dlouhé stovky až tisíce bazí (primární miRNA- pri-miRNA). Ty jsou v jádře přeměněny na prekurzorové miRNA (pre-miRNA), exportované do cytoplasmy. RNáza III je dále mění na kratší RNA duplexy známé jako miRNA. Tato miRNA je potom rozvinuta a jeden řetězec je inkorporován do komplexu RNA-induced silencing complex (RISC). Tento komplex navádí miRNA na její cílovou messenger RNA (mRNA) pomocí nepřesné vazby na její 3’-nekódující oblast (3’-UTR). Vazba tohoto komplexu na cílovou mRNA inhibuje translaci a tedy také syntézu kódovaného proteinu, ale může způsobit také degradaci této mRNA. Nepřesný způsob párování bazí dané 7-nukletidovou “seed region” v miRNA umožňuje jednořetězcové miRNA regulovat mnoho genů s homologními sekvencemi v cílových oblastech. V lidském genomu bylo dosud identifikováno více než 700 genů pro miRNA ( Předpokládá se, že 30% lidských genů je regulováno miRNA.

4 A: první způsob RT real time PCR eseje pro detekci miRNA
Sekvenčně specifické RT primery , navržené tak, aby se vázaly na 3´konec miRNA, pomocí kterých se konvertuje miRNA do cDNA. Pro vlastní real-time PCR detekci se používá 5´primer ( s vazbou na 5´oblast miRNA), univerzální reverzní primer a 5´nukleázová hydrolyzační sonda, která označí část sekvence miRNA a část sekvence reverzního primeru.

5 B: použití RNA (A) polymerázy
RNA (A) polymeráza přidá na 3´konec miRNA poly(A) řetězec. Pak se přidá univerzální RT primer, který konvertuje miRNA do cDNA. miRNA specifický primer (celá sekvence mRNA) a univerzální reverzní primery jsou použity pro identifikaci miRNA pomocí SYBR Green real time PCR esej.