Kvantitativní RT-PCR Praha 19.5.-23.5.2003.

Prezentace na téma: "Kvantitativní RT-PCR Praha 19.5.-23.5.2003."— Transkript prezentace:

1 Kvantitativní RT-PCR Praha

2 Kvantitativní RT-PCR Náplň:
různé metody kvantifikace mRNA - komparativní RT-PCR, kompetitivní RT-PCR a real-time PCR Kvantifikace transkriptů cyklinu D1, BCR-ABL a beta-2-mikroglobulinu - prakticky izolace RNA a reverzní transkripce - prakticky

3 Izolace celkové RNA Fenol (Chomczynski) Gradient CsCl Firemní kolonky
Kationtové detergenty

4 Izolace mRNA Oligo dT na nosiči (např. magnetické kuličky

5 Primers pro revezní transkripci
Oligo dT Univerzální, nižší výtěžek, nízká Tm Random hexamers/dekamers Univerzální, vyšší výtěžek, krátké úseky, nízká Tm Specifický primer Specifický, vyšší výtěžek, vysoká Tm, primer možno použít pro následnou PCR

6 Enzymy pro reverzní transkripci
Revezní transkriptázy AML,M-MuLV DNA pomlymérázy s reverzně transkriptázovou aktivitou Tth, C. therm.

7 ELFO celkové RNA Jedenotlivé bandy tRNA 28S,18S,5S

8 Průběh PCR

9 Průběh PCR

10 Jednotlivé metody kvantifikace
Komparativní PCR Kompetitivní PCR – kompetitor/ polykompetitor (konstrukt) Real Time – PCR

11 Kompetitivní PCR Koncové koncentrace produktů jsou ve stejném poměru jako koncentrace templátů i ve fázi plató Kontrola „tube to tube variation“ agar ELFO s EtBr (v pufru) Korekce na různou délku kompetitoru a stanovovaného genu Kompetitory umělé/přirozené

12

13 Real Time PCR Sledování růstu fluorescence v průběhu PCR
Různé chemikálie (sondy) Různá instrumentace

14 Kontrolní gen a návrh primerů
Pseudogeny Junction primers Konstitutivní exprese

15 Transport a uchovávání vzorků
In vivo  Periferní krev v citrátu s glc 3 dny EDTA do 24 hod Lyzát v guanidium isothiocyanát (ITG) Precipitát

16 Technické poznámky Zdroje kontaminace inhibující PCR
Kontaminovaný olej Talek Pyl z okolního prostředí Boj s kontaminacemi Oddělené laboratoře Měnit rukavice, používat sterilní buničinu „dlouhé“ špičky s filtrem Oddělit pipety na roztoky a vzorky

17 Dekontaminace Oxidační činidla Uhlíkový filtr do laminárního boxu
SAVO UV ???? Uhlíkový filtr do laminárního boxu Voda prostá RNA-áz (DEPC diethylpyrocarbonat, aqua pro inj.)