Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA

Prezentace na téma: "Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA"— Transkript prezentace:

1 Odběr a uchování biologického materiálu pro stanovení mRNA
Michal Jurajda ÚPF

2 Odběr materiálu pro izolaci RNA
Problém „biologicko-vědecký“ Problém technologický Problém organizační

3 Problém „biologicko-vědecký“
Co? Proč? Jak? Kdy?

4 Získávání materiálu Přímo v laboratoři Ve zdravotnickém zařízení
Tkáňové banky a archivy preparátů

5 Zpracovávaný materiál
Buněčné kultury Čerstvá tkáň Tkáň z tkáňových bank z parafinových bločků

6 Obecné poznámky RNázy jsou stabilní, velice aktivní a nevyžadují kofaktory Obecně potřeba pracovat v čistším prostředí než při izolaci DNA

7 Požadavky na odběr Uchování co největšího množství RNA – snaha uchovat intaktní bb. až do lýzy ve speciálním pufru. Uchování expresního profilu – okamžité usmrcení bb. a stabilizace RNA.

8 Postup práce Odběr, transport, stabilizace
Odběr,stabilizace, transport Lýza Homogenizace Izolace RNA Stabilizace (-80 nebo liqN2) Reverzní transkripce + real-time PCR

9 Postup práce Postupné zpracovávání Dávkové zpracování

10 Technologie odběru Transport in vivo Okamžitá izolace RNA

11 Technologie odběru Odběr ve zdravotnickém zařízení Stabilizace vzorku
Kultivační medium + okamžitý transport Snap-frozen, N2, ultralow freezer RNAlater PAXgene

12 Technologie izolace Příprava vzorku Lýza buněk Homogenizace
Zamražené nerozpouštět Lýza buněk Lytické pufry obsahují inhibitory RNáz Homogenizace Mechanické rozbití makromolekul Izolace RNA „no proteins = no RNA-ses“

13 Praktická realizace Fázová separace Selektivní vazba Centrifugace
Vývěvy Manuální systémy Automatické systémy

14 Kritické kroky Stabilizace kvantity i kvality RNA v tkáňovém vzorku
Uchování izolované RNA Uchování cDNA ????

15 Organizační problémy Specializovaní pracovníci popřípadě zaškolení stávajících pracovníků Přístrojové vybavení (low freezer, N2) Evidence vzorků a rychlá komunikace

16 Řešení ?

17 Řešení AMBION QIAGEN MRC Appliedbiosystems
RNAlater, RNAwiz, ToTALLY RNA QIAGEN PAXgene System, RNAeasy MRC TRI reagent Appliedbiosystems Total RNA Isolation Chemistry, ABI 6100

18 Řešení AMBION RNAlater 500ml 310€
ToTALLY RNA 100ml (pro 10g tkáně) 276€ + plastik RNAwiz 100ml 144€ + plastik + chloroform + isopropanol

19 Řešení QIAGEN PAXgene System (Tubes+Kit) 100 izolací Kč + 2x Kč RNAeasy mini kit 250 izolací Kč

20 Řešení MRC TRI reagent 500ml 50g tkáně/166ml krve 418$/455$ + plastik

21 Co? Proč? Jak? Kdy?