Izolace RNA z živočišné tkáně MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU

Zdroj RNA Čerstvá tkáň živočišného původu Slezina, játra, ledviny laboratorního potkana

Uchování a transport biol. materiálu Ihned po odběru bude následovat izolace zahájená homogenizací a lýzou vzorku. Lyzační pufr blokuje RNA-ázy. Některé postupy doporučují uchovávat lyzáty pro pozdější izolaci.

Charakter zpracovávaných tkání Buněčnost – u jater, sleziny i ledvin vysoká – max. 25μg na jednu kolonku Přítomnost lipidů – nízká Charakter extracelulární matrix – snadno mechanicky rozrušitelná

Homogenizace tkání Použijeme rotor stator homogenizátor

Izolace nukleových kyselin Použijeme RNeasy kit fy QIAGEN

Kolonky Qiagen buněčný lyzát centrifugace promytí a uvolnění

Izolační kolonky

1,5% agaróza vTBE Izolace RNA 28S 18S

Spektrofotometrické stanovení Kyveta z křemičitého skla (quartz, silica) A260 – absorbance vlastní NA A230 – absorbance složek pufru (Tris, EDTA) A280 – absorbance fenolu a proteinů (fenylalanin a tyrosin) A320 – absorbance pozadí, NA ani proteiny neabsorbují.

Odstranění RNA-áz DEPC diethyl pyrocarbonate Karcinogen Deaktivovatelný při 100 st.C http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_178.html

Vlastní postup Před prvním použitím nachystat roztoky. Přidat čistý 96-100% ethanol k RPE pufru Přidat β-merkaptoethanol k RLT pufru v poměru 10 μl na 1 ml pufru. Pozor po smíchání zůstává stabilní pouze 1 měsíc.

Vložit vzorek tkáně (20-25 μg) do 1,5 nebo 2 ml eppendorfky a přidat 600 μl RLT pufru. Okamžitě homogenizovat pomocí rotor stator homogenizátoru. Centrifugovat 3 minuty při maximálních otáčkách a supernatant přenést do nové zkumavky.

Přidat stejný objem 70% ethanolu a promíchat opakovaným nasátím pipetou. 700 μl vzorku přenést na kolonku vloženou do sběrací zkumavky. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. Možno nanést zbytek vzorku (max. 700 μl na jednu centrifugaci) a zopakovat postup Nanést na kolonku 700 μl pufru RW1 Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku.

Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 15s při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a opětovně použít sběrací zkumavku. Přidat na kolonku 500 μl RPE pufru. Centrifugovat 2 min. při minimálně 8000g. Vylít roztok, který protekl kolonkou a vyměnit sběrací zkumavku. Centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g s čistou sběrací zkumavkou-snaha odstranit veškerý ethanol. Kolonku vložit do 1,5 ml zkumavky. Nanést 50 μl RNase free water na střed membrány a centrifugovat 1 min. při minimálně 8000g. Při očekávaném výtěžku vyšším než 30 μg možno eluci zopakovat. Část eluátu nanést na agarové ELFO, část změřit na spektrofotometru. RNA uskladnit při -80 °C.