Real-time PCR - princip

Slides:



Advertisements
Podobné prezentace
Metoda QFD metoda plánování jakosti založená na principu maticového diagramu umožňuje transformaci požadavků zákazníků do navrhovaného produktu a procesu.
Advertisements

CHARAKTERIZACE DNA.
Molekulová fluorescenční spektrometrie
Poznámky identifikaci SNP
Kvantitativní RT-PCR Praha
Užití fragmentové analýzy a multiplex PCR s vícebarevným fluorescenčním značením k detekci nejčastějších mutací u dědičných neuropatií (HMSN). P. Seeman,
Masarykova nemocnice, o.z.
Sledování vlivů prostředí na modelové kultury mikroorganismů pomocí optických metod Ing. Ondřej Podrazký Školitel: Doc. Ing. Jiří Burkhard, CSc. Školitel-specialista:
Metody identifikace DNA –RFLP, PCR a RAPD
Laboratoř potravinářské mikrobiologie (Rokoska)
PCR. Polymerase chain reaction PCR Je technika, která umožňuje v krátkém času namnožit daný kus DNA bez pomoci buněk užívá se, pokud je DNA velmi malé.
Polymorfizmy detekované speciálními metodami s vysokou rozlišovací schopností Stanovení jednonukleotidových polymorfizmů (Single Nucleotide Polymorphisms.
Molekulární genetika.
SMAMII-6b Amplifikační metody.
Transkriptom.
(genové mutace, otcovství, příbuznost orgánů při transplantacích) RNA
DNA Hybridizační techniky
F.I.S.H. hotovo.
GENETICKÁ INFORMACE je informace, která je primárně obsažena v nukleotidové sekvenci v nukleotidových sekvencích jsou obsaženy následující informace: o.
Milada Teplá, Helena Klímová
MLPA MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION
Radovan Horák, Romana Zaoralová, Jiří Voller
Optické metody (pokračování) – fluorescence, fluorimetrie
Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012.
Analýza mutace C282Y v genu pro hemochromatózu
Imunochemické metody řada metod založených na principu reakce:
PCR Polymerase Chain Reaction
Kvantifikace nukleových kyselin
DNA diagnostika II..
„AFLP, amplified fragment length polymorphism“
POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE
Hybridizace nukleových kyselin
Sacharidová složka nukleotidů
Expresní DNA microarray
Technologické aspekty čipových technologií Boris Tichý LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno.
Optické metody spektrofotometrie.
Praktikum z genetiky rostlin JS Genetické mapování mutace lycopodioformis Arabidopsis thaliana Genetické mapování genu odolnosti k padlí.
Farmakogenetika Cíl Na základě interdisciplinárního integrace znalostí farmakologie a genetiky popsat vliv dědičnosti na odpověď organismu.
Diagnostické amplifikační metody nevyužívající PCR
Sekvencování DNA stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury)
Párováni bazí, hybridizace a denaturace DNA/RNA hraje důležitou roli v přírodě i aplikacích: - struktura DNA a duplikace genetické informace - transkripce.
PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce
Mikročipy ..
V praktiku budou řešeny dvě úlohy:
Molekulární biotechnologie č.10a Využití poznatků molekulární biotechnologie. Molekulární diagnostika.
SMAMII-8 Detekce polymorfismů v genomech. Metody molekulární diagnostiky Se zaměřují na vyhledávání rozdílů v sekvencích DNA a Identifikaci polymorfismů.
Ligázová řetězová reakce
Biotechnologie, technologie budoucnosti Aleš Eichmeier.
SEKVENOVÁNÍ DNA. Jedna z metod studia genů Využití v aplikovaných oblastech molekulární biologie – např. medicíně při diagnostice genetických chorob.
Environmentální aplikace molekulární biologie
Sekvencování DNA stanovení pořadí nukleotidů v molekule DNA (primární struktury)
Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese
qRT-PCR Kryostat Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Mgr. Martina Lánová RNDr. Josef Večeřa, Ph.D. Bc.
Bi5130 Základy práce s lidskou aDNA
C7188 Úvod do molekulární medicíny 3/12
Real-time PCR - princip
NÁZEV ŠKOLY: ČÍSLO PROJEKTU: NÁZEV MATERIÁLU: TÉMA SADY: ROČNÍK:
RT – PCR: návrh primerů.
Pátráme po mikrobech Díl IX. Průkaz nukleové kyseliny
SMAMII Amplifikační metody.
Užití fragmentové analýzy a multiplex PCR s vícebarevným fluorescenčním značením k detekci nejčastějších mutací u dědičných neuropatií (HMSN). P. Seeman,
DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay
Chemiluminiscence, fluorescence
Polymerase chain reaction Polymerázová řetězová rekce
Ivana Eštočinová, Pavla Fabulová, Markéta Formánková
Dominika verešová Kateřina Sapáková
1. Regulace genové exprese:
18b-Metody studia nukleových kyselin
URČENÍ BAKTÉRIE RODU BORRELIA POMOCÍ DNA SEKVENACE
MiRNA
Transkript prezentace:

Real-time PCR - princip kombinované provádění DNA amplifikace a detekce cílové nukleové kyseliny současně v jedné zkumavce pomocí světelného signálu z fluoroforů fluorofory se navazují na amplikony nebo jsou jimi značeny hybridizační sondy je možno dynamicky posuzovat průběh syntézy PCR produktu stanovení množství matrice vložené do reakce (kvantitativní PCR)

Real-time PCR - formáty flourofory s vazbou na dvouřetězcový fragment DNA = SYBR® Green I; princip 5’ → 3´exonukleázové aktivity DNA polymerázy na značené sondy = TaqMan®; princip hybridizace lineárních a nebo vlásenkových („hairpin“) sond = FRET, Beacons, aj.; princip fluoreskujících amplikonů = Amplifluor™, Scorpions;

Fluorogeny s afinitou k DNA nespecifické metody po vazbě na dsDNA a expozicí světlem o vhodné vlnové délce fluoreskují méně specializovaný, levnější a není zatížen variabilitou nukleotidových sekvencí interpretace komplikována formováním artefaktů v průběhu PCR samovolným spojováním primerů („primer-dimer“) syntézou nespecifického PCR produktu

Princip vazby SYBRTM Green I SYBR Green I

Fluorogeny – citlivost Praktická citlivost je omezena mírou nespecifické amplifikace při nízkých koncentracích amplifikovaného templátu Problémy spojené s tvorbou nespecifického signálu mohou být vyřešeny analýzami teplotních křivek tání Kratší „primer-dimer“ produkty mají zpravidla sníženou denaturační teplotu v porovnání se specifickým PCR produktem

Specifické detekční metody založeny na hybridizaci značené oligonukleotidové sondy nebo značeného primeru ke komplementátním sekvencím jednoho z řetězců PCR produktu liší se principem získávání světelného signálu

TaqMan monitoruje 5’ → 3’ exonukleázový efekt Taq DNA polymerázy na vzniklý duplex mezi sondou a jejím komplementárním řetězcem na PCR produktu Taq DNA polymeráza uvolňuje a hydrolyzuje sondu hybridizovanou v průběhu syntézy správného řetězce na matrici DNA fluorofor s excitační energií (R) a fluorofor (Q) pohlcující energii, tzv. „quencher dye“

TaqMan R Q R 5´

Princip fluorescence Absorbce světla o definované vlnové délce molekulou fluoroforu Přechod molekuly do excitovaného stavu s vyšší energii Návrat molekuly do základního stavu následovaného emisí světelného záření o jiné vlnové délce

Zhášeč - quencher Molekula schopné absorbovat nebo disipovat energii z excitovaného fluoroforu Zhášeč přijímá energii z fluoroforu a absorbuje nebo disipuje ji mechanismem „Proximálního zhášení“ nebo „FRET“

Proximální zhášení Založeno na krátké vzdálenosti mezi fluoroforem a zhášečem, která mezi nimi dovoluje efektivní přenos energie, již zhášeč převádí na teplo a tím „zháší“ excitovaný fluorofor Pokud v průběhu syntézy nového vlákna hydrolyzuje DNA polymeráza dvojitě značenou sondu, uvolní se R fluorofor z vlivu Q fluoroforu a dojde k emisi a měření excitované energie při vhodné vlnové délce Jestliže značená sonda není komplementární k sekvencím amplifikovaného produktu, nehybridizuje k templátu, nedojde k její hydrolýze a tím ani k emisi světelného signálu

FRET Fluorescence resonance energy transfer Donorová molekula (excitovaná externím světelným zdrojem) předává část své energie na akceptorovou molekulu, která vyzáří světlo o jiné vlnové délce Účinnost tohoto procesu je mimo jiné silně závislá na vzdálenosti molekuly donoru a akceptoru ( účině 100Å, cca 30 bp v lineárním formátu sond)

fluorescent resonance energy transfer FRET fluorescent resonance energy transfer FITC 3´ 5´ RED RED

Nejčastěji používané kombinace fluorofor/proximální zhášeč ve vazbě se sondou This chart shows the absorption spectra of all three BHQ dyes (conjugated to poly-T 9-mers and normalized to the T9 absorbance at 260 nm) with the emission maximum of many commonly used reporter groups indicated. BHQ1 FAM 5´ 3´

Amplifikační křivky RF 108 LF 105 102

Kalibrační křivka

Výhody real-time PCR stejná nebo vyšší citlivost bez manipulace se vzorky – snížení rizika kontaminace není třeba provádět elektroforézu automatizace procesu pro klinické využití kvantifikace templátu – množství patogena, hladina mRNA rozmanité typy sond – více lokusů v jedné reakci (multiplex)

Analýza bodových mutací

Real Time přístroje RotorGene (Corbet Research) LightCycler (Roche) Systém ABI

Použití FRET analýzy pro detekci SNP modelový příklad Standardní alela o délce 200 bp CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATCTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTC Mutantní alela (s mutací v jediném nukleotidu) o délce 200 bp CCTCCTGCCTCTACCAATCGCCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGACTCCACCTTTGAGAGCCACTACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACCTTCCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATCTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTC

Návrh sond pro detekci SNP pomocí FRET GAGAGATCACTCAT-FITC RED-CCATGCAGTGGAA GACTCCACCTTTGAGAGATCACTCA(C)TCCTCAGGCCATGCAGTGGAA

Princip analýzy SNP pomocí FRET sond Mutantní alela (dCTP) Tm= 55°C RED FITC Standardní alela (dATP) Tm= 62°C RED FITC

Výsledek detekce SNP pomocí FRET Základní data

Vyhodnocení detekce SNP s použitím FRET pomocí analýzy křivky tání Tm analysis of real-time PCR with SYBR Green as fluorescent dye. Tm analysis allows the differentiation of specific PCR product (amplicon) from non-specific amplification products, such as primer-dimers. Samples: 1 to 7, patient samples (stool); 8, negative control (water); 9, positive control (NoV positive stool). Amplified products from NoV template RNA can be reliably distinguished from non-specific products by different melting points. The melting temperature for the positive samples was 79.0 +/- 0.5°C. Non-specific products melt at lower temperatures