Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese

Prezentace na téma: "Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese"— Transkript prezentace:

1 Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese
In vitro metody Manipulace s DNA Manipulace s proteiny Analýza genové exprese

2 1.1 Manipulace s DNA 1) Chemické metody Izolace (srážení, purifikace)
Separace (elektroforéza) Hybridizace/denaturace 2) Enzymatické metody Štěpení (restrikční endonukleázy) Ligace (lepení) (ligázy) Syntéza (DNA polymerázy) PCR

3 Izolace nukleových kyselin
DNA: Střižné napětí (štěpení) Stabilní v zásaditém prostředí RNA: RNázy (jsou všude) Stabilní v kyselém prostředí Postup: Lyze buňky (enzymaticky, mechanicky, chemicky, osmoticky) Odstranění proteinů (fenol/chloroformová extrakce) Srážení DNA/RNA (NaAc + ethanol) Centrifugace (sraženina) Resuspendace v pufru/vodě

4 Centrifugace Rychlostní: Sediment x supernatant Separace: Buněk
Sraženiny (DNA) Organely Gradientová: CsCl gradient Sacharózový gradient

5 Gelová elektroforéza Separační i analytická metoda
vzorek - marker Separační i analytická metoda Náboj je úměrný velikosti Agarózový gel Stejnosměrné elektrické pole Ethidium bromid Iluminátor 8000bp 5000bp 4000bp 3000bp 1500bp 1000bp 500bp +

6 Pohyblivost závisí na:
Délce DNA molekuly Konformace (kruhová x lineární) Koncentraci agarózy Napětí

7 Denaturace + hybridizace
Denaturace = oddělení řetězců DNA Podmínky: teplota, činidlo (hydroxid, formamid, močovina) Hybridizace: opačný proces než denaturace (i DNA:RNA) Použití: Lokalizace intronů, hybridizační sondy, PCR

8 Restrikční endonukleázy
Štěpí dsDNA Palindromatické sekvence Použití: Štěpení specifických míst Štěpení s definovanými konci

9 Restrikční mapa DNA molekuly

10 Ligace Tvorba fosfodiesterové vazby mezi 2 řetězci DNA Enzym ligáza
Preference: kohezní konce Spotřeba ATP

11 SalI ligáza TGCATGGTCAGTATGCG ACGTACCAGTCATACGCAGCT TGCATGGTCAGTATGCGTCGACAGTACGAGCAATCGATG ACGTACCAGTCATACGCAGCTGTCATGCTCGTTAGCTAC TCGACAGTACGAGCAATCGATG GTCATGCTCGTTAGCTAC Restriktáza + ligáza = systém pro úpravu DNA molekul Molekulární DNA klonování

12 Enzymová syntéza DNA Komponenty: 1. ssDNA (templát)
2. Specifický primer (cca 20 bp) - chemická syntéza 3. dNTP + pufr (Mg2+) 4. DNA polymeráza Použití: Značená DNA sonda Tupení přesahujících konců PCR (amplifikace úseku DNA) Mutagenesis in vitro DNA polymerázy: Bakteriální DNA pol. I Klenowův fragment (nemá 5→3 exo) Archae - termostabilní (Taq, Pwo) Souvislosti: DNA - Replikace

13 Použití enzymatické syntézy DNA
1. Vytvoření sondy 2. PCR 3. Cílená In vitro mutageneze 4. Tvorba copy DNA

14 1. Značení DNA (sondy) Značky: Radioaktivní (32P) Fluorescenční
Dále detekovatelná značka (např. protilátkou) Způsoby: Značení konců Primer extension Nick translation

15 1. In situ hybridizace Sonda Fixace buňky, denaturace Hybridizace
Lokalizace mRNA: deltaC RNA Danio rerio (zebrafish) Lokalizace genů: Lidský 5. chromozóm 6 genů Jadérko: rRNA

16 2. Polymerase chain reaction (PCR)
Amplifikace konkrétního úseku DNA, vymezeného primery templátová DNA 2 primery DNA polymeráza dNTP Princip: cyklické trojkrokové střídání teploty: 94 0C – denaturace C – hybridizace (templát + primer) 72 0C – syntéza (termostabilní polymeráza) Thermus aquaticus

17 VIDEO

18 2. Forenzní genetika - Kdo je vrah?
Genetický materiál pachatele Genetický materiál podezřelého Osoba A Osoba B Osoba C ???

19 Odbočka - mikrosatelity
Mikrosatelity (short tandem repeats) Počet repetic se při replikaci může změnit: Uklouznutí DNA pol.: inzerce/delece Polymorfismus D7S820

20 DNA fingerprinting Kdo je vrah???

21 3. In vitro mutagenesis DNA fragment jako kruhová ssDNA (vektor: M13 fág) Primer - obsahuje mutaci (inzerce, delece, substituce) Syntéza DNA Rozeznání nového řetězce (není methylovaný, α-S-dNTP) Degradace starého řetězce, nová syntéza VIDEO Souvislosti: Metody - Genové inženýrství

22 3. In vitro DNA mutagenesis Přehled strategií

23 4. Syntéza cDNA Copy "DNA" = produkt reverzní transkripce mRNA
Neobsahuje introny: Lze exprimovat v bakteriích Kratší úsek Klasický postup: Poly(T) primer Reverzní transkripce Degradace RNA (RNáza H) Syntéza 2. vlákna DNA: primer z RNA nebo specifický primer

24 DNA - detekce/amplifikace
Detekce, in vitro amplifikace, in vivo amplifikace Genové inženýrství

25 1.2 Manipulace s proteiny Separace proteinů Chromatografie
SDS elektroforéza Izoelektrická fokusace 2. Identifikace proteinu Hmotnostní spektrometrie 3. Protilátky Výroba protilátek Průtoková cytometrie Fluorescence-activated cell sorting

26 1. Chromatografie Separace látek podle vlastností
Sloupcová chromatografie: colona + matrice + vzorek Rozdělení molekul podle rychlosti (záleží na matrici) Typy: afinitní, gelová filtrace, ionexová

27 1. SDS PAGE Princip stejný jako DNA elektroforéza, ale proteiny se liší nábojem Denaturace SDS - udělí proteinu náboj úměrný velikosti Redukční činidlo (merkaptoethanol, DTT): redukce S-S můstků Gel: polyakrylamid VIDEO

28 1. Izoelektrická fokusace + 2D ELFO
Izoelektrický bod = pH při kterém je celkový náboj proteinu nulový Izoelektrická fokusace - separace proteinů podle náboje Gradient pH - protein putuje a mění náboj 2D elektroforéza: izoelektrická fokusace + SDS elektroforéza

29 2. Hmotnostní spektrometrie
Izolace proteinu Štěpení na fragmenty (trypsin za K, R) Ionizace vzorku (např. MALDI) Určení m/z fragmentu (např. TOF) 5) Fingerprinting - hledání v databázi

30 2. Sekvenování proteinů (MS/MS)
Postup jako při fingerprintingu Peptidy se dále štěpí (srážka s N2) Fragmenty se analyzují na MS Rozdíl mezi vrcholy: 1 aminokyselina Rozeznání C a N konce - značení Trojitý kvadrupól

31 3. Protilátky Velmi široké uplatnění v biologii: Detekce proteinů
Výroba protilátek: Imunizace myši Izolace B buněk (slezina) Fúze s leukemickou buněčnou linií Selekce hybridomů Selekce žádoucích hybridomů Imunogen: Zejména proteiny ale i jiné molekuly (lipidy)

32 3. Průtoková cytometrie Princip: Kapilára Buňky procházejí skrz laser
Měření fluorescence Použití: Povrchové proteiny (protilátky) Proteiny uvnitř buňky (po permeabilizaci) Obsah DNA (fluorescenční barva) Velmi dobrá kvantitativní analýza

33 3. Fluorescence-activated cell sorting
Aplikace průtokové cytometrie Kapce se udělí náboj podle signálu Třídění směsné populace buněk

34 1.3 Analýza genové exprese
Metody sledování exprese individuálního genu Northern + Western Kvantitativní RT-PCR 2. Sledování celkové genové exprese Microarrays Proteomika (Pozn. metody bez použití genového inženýrství)

35 1. Northern blotting Southern blotting (přesátí): DNA elektroforéza
Přesátí na membránu (např. nitrocelulóza) Inkubace se značenou DNA sondou Spíše in vitro mapování molekul Northern blotting: Izolace RNA → RNA elektroforéza Přesátí na membránu Kvantifikace množství mRNA genu (transkripce)

36 1. Wester blotting (immunoblotting)
Izolace proteinů SDS PAGE Transfer na membránu Inkubace s protilátkou (někdy primární + sekundární) Detekce Umožňuje kvantifikaci množství proteinu

37 1. Kvantitativní RT-PCR VIDEO Terminologický problém: (RT = real time/reverse transcription) Slouží k určení množství konkrétní mRNA Probíhá ve dvou fázích: Syntéza cDNA Amplifikace cDNA (klasické PCR) Sledování množství produktu v reálném čase (fluorecescence) TaqMan

38 2. Microarray (DNA čipy) Porovnání celkové genové exprese
2 vzorky (2 tkáně, 2 podmínky růstu, zdravá tkáň x nádor) Izolace mRNA z tkáně Syntéza značené cDNA (2 různé fluorofory) Hybridizace na čipu (kotvená cDNA) Měření fluorescence (poměr) VIDEO

39 2. Proteomika Porovnání proteomu ze 2 vzorků Klasický postup:
2x 2D ELFO (i jiná vícerozměrná separace) Obrazová analýza Identifikace spotů (MS) Nové metody: Fluorescenční značení vzorků - směs

40 Shrnutí Molekuly DNA lze izolovat, separovat, štěpit, lepit, množit
Značená DNA sonda může být použita k detekci NA in situ PCR = základní mol. biologická metoda (např. forenzní genetika) Proteiny lze in vitro separovat (SDS PAGE, 2D ELFO) Lze vyrobit protilátku proti (libovolnému) proteinu FACS počítá a třídí buňky podle fluorescence Exprese genu lze sledovat jako množství mRNA nebo proteinu Analýza transkriptomu/proteomu ukáže globální změny GE

41 Co si určitě zapamatovat?
Elektroforéza DNA Restrikční štěpení + ligace DNA sondy PCR cDNA Hmotnostní spektrometrie Protilátky Průtoková cytometrie Metody sledování genové exprese