DNA Hybridizační techniky

Prezentace na téma: "DNA Hybridizační techniky"— Transkript prezentace:

1 DNA Hybridizační techniky

2 Obsah Princip metody Rozdělení metod
Technika měření reasociační kinetiky Využití metody Výhody a úskalí

3 Princip metody DNA lze snadno denaturavat na jednotlivé komplementární řetězce Za vhodných podmínek komplementární řetězce reasociují na dvouřetězec Míra v jaké a rychlost s jakou dva jednořetězce reasociují závisí na stupni jejich podobnosti

4 Základní uspořádání Reasociace s DNA na pevném nosiči
Dot blot Slot blot Southern blot Reasociace ve vodném roztoku

5 Měření reasociace v roztoku
Izolovat (purifikovat) DNA Nalámat na vhodnou délku (500 pb) Změřit přesně její koncentraci Denaturovat teplem Smísit DNA dvou porovnávaných druhů Postupně ochladit Změřit procento renaturované DNA Vypočíst podobnost sekvencí Vypočíst počty mutací od okamžiku odvětvení

6 Kvantifikace reasociace
Stanovit střední teplotu tání homoduplexů Tm= (TmA + TmB)/2 Stanovit teplotu tání heteroduplexu Vypočítat pokles ΔTm ∆Tm=((TmA + TmB)/2) - Tms Vypočítat p p = ΔTm . 0,01 (0,015) K = -3/4 ln(1 - 4/3 p)

7 Technické triky Tracer a driver Odstranění repetitivních sekvencí
Způsoby monitorování míry reasociace Extinkce jednořetězcové a dvouřetězcové DNA Chromatografické oddělení na hydroxyapatitu Rozštěpení ssDNA pomocí S1 nukleázy

8 A B fragmentace denaturace radioaktivní značení renaturace S1 štěpení detekce

9 Výhody metody Multilokusová (totilokusová) metoda
Použitelná na nejvzdálenější taxony

10 Nevýhody metody Distanční metoda Experimentálně dosti náročná
Práce s izotopem Vyžaduje speciální vybavení Vyžaduje větší množství DNA (mg) Náchylná k artefaktům (repetitivní DNA) Experimentální náročnost N x N

11 Závěry Na velmi vzdálené taxony výhodné
Měla by provádět specializovaná laboratoř Většinou lze nahradit jinými metodami (MLST) V budoucnu možná taxonomické DNA čipy