Laboratoř potravinářské mikrobiologie (Rokoska)

Prezentace na téma: "Laboratoř potravinářské mikrobiologie (Rokoska)"— Transkript prezentace:

1 Laboratoř potravinářské mikrobiologie (Rokoska)
Ústav 320 Lucie Vondráková prof. Ing. Kateřina Demnerová, CSc. doc. RNDr. Jarmila Pazlarová, CSc.

2 Úvodem … Termotolerantní Campylobacter spp. G- tyčinky
Mikroaerofilní atmosféra Optimální teplota 42 °C Onemocnění Akutní střevní infekce tzv. kampylobakterióza C. jejuni (80-85 %) C. coli C. lari Infekční dávka velmi nízká Závažné postinfekční komplikace

3 Detekce, identifikace a kvantifikace termotolerantních Campylobacter spp.
ČSN EN ISO 10272–1 Mikrobiologie potravin a krmiv - horizontální metoda průkazu a stanovení počtu Campylobacter spp. Selektivní pomnožení Problém rozlišení mezi jednotlivými druhy Nízká biochemická aktivita kampylobakterů Rostoucí počty rezistentních kmenů Časová náročnost

4 Multiplex qPCR detekce, druhová identifikace
primery cílené na druhově specifické geny C. jejuni – hipO (hipurikasa) C. coli – glyA (serin hydroxymethyltransferasa) C. lari – pepT (peptidasa T) absolutní kvantifikace a možnost provedení v multiplexu vynechání pomnožovacího kroku zjištění počtu porovnáním se standardními křivkami triplex – duálně značené hydrolyzační sondy

5 Návrh protokolu qPCR a výsledky
In silico analýza FastPCR nBLAST výběr, chemické modifikace, nastavení experimentu Experimentální postup klasická PCR s elektroforetickým vyhodnocením singleplex/multiplex real-time PCR se SYBR Green křivka tání s cílovými i dalšími druhy kampylobakterů

6 Analýza křivky tání C. lari C. coli C. jejuni

7 Návrh protokolu qPCR a výsledky
singleplex qPCR multiplex qPCR DNA vzorek jednoho druhu/směsný vzorek DNA validace protokolu na reálných vzorcích - oplachy kuřecích křídel - umělá kontaminace v rozsahu CFU/ml - porovnání s klasickou metodou počítání CFU na miskách - kvantifikace pomocí qPCR možná i u nejvyššího ředění - misky – C. jejuni při nejvyšším ředění 100 % negativní, C. coli 33 % a C. lari 67 %

8 Závěrem Analýza dat a satistika
Druh Efektivita (%) LOD (CFU/rce) R2 Slope C. jejuni 90.85 6.62 < LOD < 16.10 0.998 -3.565 C. coli 96.97 5.13 < LOD < 6.30 -3.399 C. lari 92.89 4.87 < LOD < 5.23 -3.506 Analýza dat a satistika 7500 Software (Applied Biosystems, USA, verze 2.0.5) GenEx software (MultiD Analyses AB, Sweden, verze GenEx 5 Enterprise) MIQE guidelines

9 Děkuji za pozornost