Izolace genomové DNA Základní kroky: Biologický materiál: Růst kultury, buněk, odebrání tkáně,.. Lyze buněčných stěn a organel Odstranění proteinů, polysacharidů, RNA, zbytků membrán DNA recovery - Vysrážení DNA - Rozpuštění DNA Biologický materiál: myší buněčná linie prsního karcinomu 4T1

Postup - příprava materiálu Buněčnou kulturu necháme růst na Petriho misce ve vhodném médiu do konfluence 60-80% 2. Kultivační medium odlijeme, buněčnou kulturu opatrně opláchneme 1ml 1xPBS, odlijeme do odpadní nádoby Přelijeme 1ml roztoku 1mM EDTA v 1xPBS, 4 minuty inkubujeme při pokojové teplotě Buňky oddělíme od podkladu mechanicky opakovaným oplachem proudem tekutiny pomocí pipety Suspenzi odlepených buněk přeneseme do čisté 1,5ml zkumavky Buňky centrifugujeme 400g/5 min/4 °C Supernatant pečlivě odpipetujeme

Postup – lyze buněk Pelet buněk suspendujeme ve 400µl pufru A (0,4 M NaCl, 10 mM Tris–HCl pH=8, 2 mM EDTA) Přidáme: 10 µl RNAzy (výsledná koncentrace 100 ug/ml) 80 µl 10% SDS 8 µl proteinázy K (zásobní roztok 20 mg/ml) Opatrně promícháme a inkubujeme 1 hod při 55 °C.

Postup – vysrážení a odstranění proteinů Přidáme 360 µl 5M NaCl promícháme převracením centrifugujeme 12,000 RPM/10 min/4 °C supernatant přeneseme do čisté mikrocentrifugační zkumavky !! Použijeme špičku s odstřiženým koncem!!

Postup – vysrážení a rozpuštění DNA přidáme stejný objem vychlazeného izopropanolu (360 µl) promícháme převracením dokud se nevysráží vlákno genomové DNA Centrifugujeme při 12 000 RPM/10 min/4 °C. Opláchneme sediment 1ml 70% etanolu, inkubujeme 5 minut. Odstraníme roztok etanolu, sediment osušíme a rozpustíme v 50 µl TE pufru. Změříme koncentraci a čistotu na Nanodropu.

Homogenizace tkání a lyze buněk Detergent Var Sonikace (ultrazvuk) Opakované rychlé zamražení/rozmražení Enzymy (narušení buněčné stěny, narušení tkáně) Mechanická dezintegrace (hmoždíř, „vortex“ s pevnými částicemi …)

Odstranění kontaminant RNA RNáza A – štěpí za pyrimidiny Proteiny proteináza K, extrakce fenol/chloroform, vysolení, …

DNA recovery Chrometografické kolony Silika kuličky Srážení alkoholy Chelex – nízká čistota, pro PCR ve forenzní genetice

Specifika manipulace s genomovou DNA Pro zvýšení celistvosti izolované DNA jsou doporučovány špičky s velkým průměrem okolo 3mm (například nůžkami ustřižený konec). Rovněž při centrifugaci dbáme na nízkou akceleraci a deceleraci centrifugy! Celkově s roztokem DNA zacházíme šetrně, bez prudkých pohybů. Celistvost DNA zkontrolujeme elektroforetickou separací na agarosovém gelu. DNA by měla být patrná jako celistvý, vysokomolekulární proužek. Pokud je místo jednolitého proužku patrná “šmouha”, značí to, že DNA byla degradovaná.