Čištění GFP z lyzátu E.coli pomocí sloupcové chromatografie Separace Čištění GFP z lyzátu E.coli pomocí sloupcové chromatografie

Kroky experimentu Protokol Materiál

Bezpečností upozornění Při práci s UV lampou používejte ochranné brýle!!

1. Příprava sloupcové chromatografie Úkol 1: Zkontrolujte lyzát E.coli ve vaší zkumavce na UV-stole – fluoreskuje? Zaznamenejte vaše zjištění!

1. Příprava sloupcové chromatografie 1.1 Vlože bakteriální lyzát do centrifugy a odstřeďujte ho po dobu 10 minut při 1300 rpm (otáčky za minutu) TE-pufr supernatant

1. Příprava kolony 1.2 Protřepejte chromotografickou kolonu (30 sec) abyste promíchali gel. 1.3 Čekejte 2 minuty až se gel usadí. 1.4 Otevřete kolonu nejdřív nahoře a potom i dole.

1. Příprava chromotografie 1.5 Nechte roztok zcela vykapat z kolony. 1.6 Napipetujte 2 ml vyrovnávacího pufru (EB) po stěně kolony. 1.7 Nechte vyrovnávací pufr protéct kolonou až ke značce 1 ml. 1.8 Zavřete kolonu nahoře i dole.

1. Příprava na chromatografii 1.9 Vyjměte vaši zkumavku z odstředivky. Úkol 2: zkontrolujte vaši zkumavku s odstředěným E.coli lyzátem pod UV světlem bez rozptýlení usazeniny!! Zaznamenejte vaše zjištění! 1.10 Napipetujte 250 µl supernatantu z odstředěného bakteriálního lyzátu do žluté zkumavky, která obsahuje 250 µl vázacího pufru (BB).

2. Provedení sloupcové chromatografie 2.1 Očíslujte vaši zkumavku. 2.2 Otevřete chromatografickou kolonu a nechejte roztok vytékat, dokud nebude kolona zcela prázdná. 2.3 Umístěte kolonu na testovací zkumavku. Během stacionární fáze byste s chromatografickou kolonou neměli třepat.

2. Provedení sloupcové chromatografie 2.4 Napipetujte 250µl naředěného bakteriálního lyzátu ze žluté BB zkumavky do kolony a nechte stékat po stěně kolony. 2.5 Nechte protéct roztok kolonou, dokud nebude zcela prázdná. Při pipetování vložte špičku pipety na horní okraj roztoku.

2. Provedení sloupcové chromatografie Úkol 3: zkontrolujte kolonu pomocí UV světla – zda je přítomen GFP. Zaznamenejte vaše zjištění!

2. Provedení sloupcové chromatografie 2.6 Vložte chromatografickou kolonu na testovou zkumavku číslo 2. 2.7 Po stěně kolony napipetujte 250µl vymývacího pufru (WB).

2. Provedení sloupcové chromatografie Úkol 4: zkontrolujte kolonu na přítomnost GFP pomocí UV světla Zaznamenejte vaše zjištění!

2. Provedení sloupcové chromatografie 2.8 Vložte chromatografickou kolonu do testové zkumavky č. 3. 2.9 Napipetujte do kolony 750µl vymývacího pufru (EB). Rada : Abyste získali čistý GFP, můžete kolonu během vymývání GFP umístit na novou zkumavku.

2. Provedení sloupcové chromatografie Úkol 5: zkontrolujte přítomnost GFP v koloně v průběhu vymývání pomocí UV světla Zaznamenejte svá zjištění.

Uchování eluátu až do kontroly čistoty Přeneste eluát z testovací zkumavky č. 3 do nové zkumavky a uskladněte při -18°C až do provedení kontroly čistoty, kterou proveďte pomocí polyacrylamidové gelové electroforézy.

3. Čištění a uchovávání chromatografických sloupců Čištění: Sloupce opláchněte 2 ml 70% ethanolu. Uchovávání: Sloupce se zředí 2 ml 20% ethanolu, a takto mohou být přechovávány při pokojové teplotě.